闪式提取法提取山药中薯蓣皂素的工艺研究

赵明蕊 辛梦雨 任相莲

1.河南医学高等专科学校药学系，河南新郑 451191；2.郑州大学药学院，河南郑州 450000

薯蓣皂素，又称为薯蓣皂苷元（diosgenin），可由薯蓣皂苷水解而来，分子结构式见图1，是合成甾体激素药物的基础原料和起始中间体[1-3]，而且有祛痰、降脂、抗炎、抗肿瘤等作用，具有较高的药用价值[2-4]，山药为薯蓣类作物[2]，从山药中提取薯蓣皂素对综合开发利用怀山药，促进农民增收，帮助农户脱贫致富具有一定的指导作用。目前，薯蓣皂素提取方法很多，主要是传统的先水解后提取法，先提取后水解法，以及超临界CO2法，表面活性剂法及改进的超声波法等[1，4-6]，但大都在较高温度或高压下进行，且耗时较长，因此开发快速高效的提取方法具有较高的应用价值。已有研究表明，相比于索式提取（0.26%）及超声提取（0.32%）的提取率，闪式提取法提取山药中的薯蓣皂素，提取率高达0.50%[7]，但该研究未提及提取溶剂，且未对提取条件进行优化，在实践中缺乏可操作性。基于前期对薯蓣皂素的溶解度[8]和超临界提取方法的研究[9]，本实验先对薯蓣皂素闪式提取法的提取溶剂进行选择，再通过单因素实验和正交实验对工艺条件进行优化，获得最佳工艺，以达到可实践性强，且提取快速、高效、节能的目的，为山药的进一步综合利用提供理论依据。

图1 薯蓣皂素的分子结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山药（焦作温县）；乙醇、碳酸钠、80%乙醇、石油醚（60～90℃）、高氯酸，均为分析纯（天津科密欧化学试剂有限公司）；闪式提取器、刮膜闪蒸仪（北京金鼐科技发展有限公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA）；紫外可见分光光度计（北京莱伯泰仪器有限公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多）；电热恒温水浴（上海旬乐仪器有限公司）；TDL-5-A型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 薯蓣皂素的制备 取怀山药，去皮，切片，干燥，加入含5%硫酸的提取溶剂后，用闪式提取器进行提取后，离心分离后，取上清液，加热水解至规定时间，回收有机溶剂，冷却，使用饱和碳酸钠溶液中和，离心分离得到滤渣，将滤渣置于干燥皿在80℃烘箱中干燥，即得到水解物。

将上述干燥的水解物加入石油醚，用闪式提取器提取后，转入旋转蒸发器中，常压回收石油醚至干，即得薯蓣皂素粗品。将上述粗品加20～30mL 95%乙醇加热溶解。放置析出结晶，抽滤，移取结晶，烘干，即得薯蓣皂素精品[10]，计算得率。薯蓣皂素得率的测定：得率（mg/g）=提取的薯蓣皂素的质量（mg）/原料的质量（g）

1.2.2 薯蓣皂素含量的测定 根据参考文献[11]稍加变化测定薯蓣皂素的含量。标准曲线的绘制：准确称取薯蓣皂素标准品3.0mg，在105℃干燥至恒重，加石油醚于25mL容量瓶定容，混匀，作为标准溶液（0.12mg/mL）备用。精密吸取1、2、3、4、5、6mL的标准溶液于10mL带刻度小试管中，挥发溶剂，加高氯酸10mL，置于30℃水浴中保温15min，取出冷却至室温，测定吸光度A。标准曲线见图2，求得回归方程为A=0.152 95C+0.0618，其中C为薯蓣皂素浓度（g/L），A为吸光度，由图2可以看出，薯蓣皂素含量和吸光度在0.12～0.62g/L范围内呈良好的线性关系，相关系数R2=0.9999。

图2 薯蓣皂素浓度-吸光度标准曲线

按上述方法将制备的薯蓣皂素供试品配成溶液：准确吸取一定量供试品溶液于10mL比色管中，待溶剂挥发后，加高氯酸10mL，置于30℃水浴中保温15min，取出冷却至室温，在410nm波长下测定吸光度，根据吸光度，稀释至标准曲线的浓度范围区间，并计算供试品中薯蓣皂素的浓度。

1.2.3 薯蓣皂苷提取溶剂的选择 分别以乙醇+正丁醇（1∶1）[8]、80%乙醇[10]及70%甲醇[11]为提取溶剂对山药中的薯蓣皂素进行提取，考察薯蓣皂素的得率。

1.2.4 薯蓣皂苷提取料液比的选择 准确称取山药样品25g置于闪式提取器中，分别控制提取溶剂体积与样品的物料比1∶6、1∶8、1∶10、1：12、1∶14、1∶16，设定提取1次和提取时间2min，进行闪式提取。然后按照“1.2.1”项方法制备得薯蓣皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”项方法测定，计算薯蓣皂素得率。

1.2.5 薯蓣皂苷提取水解时间的选择 准确称取样品25g置于闪式提取器中，加入250mL提取溶剂，设定提取时间2min，进行闪式提取。提取液加热回流1、2、3、4、5h进行水解。然后按照“1.2.1”项方法制备得薯蓣皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”项方法测定，计算薯蓣皂素得率。

1.2.6 薯蓣皂苷提取次数的选择 准确称取样品25g置于闪式提取器中，加入250mL提取溶剂，设定提取时间2min，进行闪式提取，提取次数为1、2、3次。每一次的提取液按照“1.2.1”项方法制备得薯蓣皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”项方法测定，计算薯蓣皂素得率。

1.2.7 水解物薯蓣皂素提取条件的优化 以石油醚（60～90℃）为溶剂，进行闪式提取，根据初步试验结果，考察石油醚料液比、提取时间、提取次数3个因素（每个因素确定3个水平）对山药中薯蓣皂素得率的影响。按照正交实验表L9（34）进行实验，见表1，以薯蓣皂素得率为评价指标，进行直观法和方差分析法分析其结果，以获得山药中提取薯蓣皂素的最佳工艺条件。

表1 正交实验因素及水平表

2 结果与分析

2.1 薯蓣皂苷提取溶剂的选择

以乙醇+正丁醇（1∶1）、80%乙醇及70%甲醇为溶剂时，山药中薯蓣皂素的得率分别为5.08、7.65、7.41mg/g。可能山药中诸多共存的其他成分，影响薯蓣皂苷在各种溶剂中的溶解性，而且薯蓣皂苷属于甾体皂苷，在植物体内与糖结合成苷，极性较大，在80%乙醇及70%甲醇中溶解度较高，虽然经水解得到的薯蓣皂素（薯蓣皂苷元）极性较小，可能在乙醇+正丁醇（1∶1）溶解度会增加，但首先需要把薯蓣皂苷提取出来，才能获得薯蓣皂素，从而提高薯蓣皂素的得率，因此选择含水醇为提取溶剂。此外，虽然80%乙醇及70%甲醇为提取溶剂，薯蓣皂素的得率相差不大，但考虑到溶剂的毒性程度，选择了80%乙醇。

2.2 薯蓣皂苷提取料液比的选择

在闪提2min条件下，80%乙醇体积用量增加对薯蓣皂素得率的影响见图3，结果表明，80%乙醇用量增加可以在一定程度提高薯蓣皂素的得率，但当体积增加超过250mL，80%乙醇体积用量的增加对薯蓣皂素得率的影响基本不会发生较大的变化，因此选择料液比为1∶10。

图3 薯蓣皂素得率随80%乙醇体积用量的变化

2.3 薯蓣皂苷水解时间的选择

在80%乙醇体积用量250mL，料液比1∶10情况下，闪提时间2min时，薯蓣皂素得率与闪提时间的关系见图4，在2h时，得率已趋于稳定，随着时间的增加，薯蓣皂素的得率略有下降，因为2h后皂苷已水解完全，在3、4h皂苷元得率处于一种平稳趋势，也证明了反应已经基本完全，随着水解时间的继续增加，容易造成部分薯蓣皂苷元转化成△3，5-双烯的结构[1]。所以薯蓣皂苷水解2h为最佳水解时间。

图4 薯蓣皂素得率随水解时间的变化

2.4 薯蓣皂苷提取次数的选择

以5%硫酸的80%乙醇溶液，提取薯蓣皂苷1、2、3次，每次提取液水解2h后，继续后续操作，提取薯蓣皂素，其提取率分别为7.62、0.03、0.01mg/g，说明虽然提取2、3次还能继续提取出少量薯蓣皂素，但经1次提取后，薯蓣皂苷已经完全提取。考虑到能耗，选择薯蓣皂苷提取1次。

2.5 正交实验结果与分析

选择提取因素A（料液比）、B（提取次数）、C[提取时间（min）]、D（空白）四因素的三水平做正交实验，对薯蓣皂素得率（mg/g）结果进行分析，正交实验结果见表2。

表2 正交实验数据表

由表2数据方差分析可知，料液比和闪提次数对得率的影响显著，闪提时间对得率影响较小。从正交实验结果极差分析可知，最佳提取工艺为A2B3C1D2，即最佳工艺条件为料液比为1∶10，提取3次，提取时间2min。虽然提取第2次，第3次还能继续提取出少量薯蓣皂素，但经1次提取后，薯蓣皂苷已经基本提取完全。考虑到能耗，选择薯蓣皂苷提取1次。

由结果可知，可利用薯蓣皂素不溶于水，易溶于有机溶剂的性质，利用石油醚进行提取，但单位质量薯蓣皂苷水解产生的薯蓣皂素的量是一定的，所以提取溶剂石油醚的用量并非越多越好，而是存在最佳值，即1∶10。

2.6 闪式提取的验证实验

按照选定的条件重复实验3次，得率分别为8.15、8.16、8.11mg/g，平均值为8.14mg/g，均高于表中其他组合的得率，说明优化的薯蓣皂素提取工艺是合理的。

3 讨论

薯蓣皂素的分光光度法测定，具有操作简单、费用低、灵敏度高、重现性好等优点，且经过较系统的实验研究表明，该法的测定结果与GC、HPLC测定结果基本一致[11-12]，因此本研究以高氯酸为显色剂，用分光光度法测定其含量。

在中药提取工艺中，与回流法、浸渍法、渗漉法、索氏提取法，超声提取法相比，闪式提取法具有简便、安全、节能、污染小及收率高等优势[13-14]，被认为是一种既能促进中药化学成分提取技术发展，又能加快中药制剂的制取速度[15-16]，已被广泛用于皂苷[16-17]、木脂素[18]、黄酮[19]、多糖[20]、油脂[21]等多种成分的提取。采用2次闪式提取法对山药中的薯蓣皂素进行提取，最佳工艺条件为：5%硫酸的80%乙醇溶液，料液比1∶10，闪式提取1次，提取时间2min后，加热水解2h，离心分离，取上清液，回收溶剂，收集残渣，冷却，使用1%碳酸钠溶液中和，离心分离得到滤渣，将滤渣置于干燥皿在80℃烘箱中干燥，所得水解物以石油醚进行提取，此时的料液比为1∶10，再次闪式提取1次，提取时间2min，闪式提取器的主要理论依据是中药组织内部的各种有效成分在合适溶剂的存在下，随着高速粉碎与搅拌的外力，细胞组织碎裂、有效分子解离、使组织外围溶剂溶解，从而形成新的平衡体系，迅速实现药材组织内外有效分子浓度的均衡，进而达到快速提取的目的。本实验使用2次闪式提取的优化方法，使薯蓣皂苷和薯蓣皂素的提取在数分钟内即可完成，大大节约了能源；此外，本工艺的得率为0.814%，而未优化的闪式提取法得率为0.50%，也说明了本工艺的可行性。

酸水解法进行薯蓣皂素的提取的原理是通过强酸作用破坏植物细胞壁，从而破坏连接薯蓣皂素的皂苷键，水解生成苷元和糖类[22]。而直接酸水解时，因根茎中含量较高的纤维素和淀粉也被水解，硫酸消耗巨大，而且最后的酸水外排，造成环境污染。本研究的闪式提取，使用5%硫酸与80%乙醇溶液，在2min内即可快速破坏细胞壁，使薯蓣皂苷释放到溶液中，且以乙醇为溶剂，又较大程度避免了纤维素和淀粉进入提取液，避免共存的杂质成分对薯蓣皂苷水解的干扰。此外，加热提取液进行酸水解，使薯蓣皂苷在溶液状态下水解，既可降低酸用量（从传统的10%[10]降至5%），又可缩短水解时间（使薯蓣皂苷从文献报道的最佳5.5h[1]，降低至本实验的2h），而且在回收有机溶剂后的水溶液中，使用饱和碳酸钠溶液中和，减少了酸排放。因此，闪式提取法提取薯蓣皂素是一种快速、高效、环保的提取方法，具有较高的应用价值。