铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物对降解烃类的影响作用

黄 璐， 聂麦茜， 胡 睿， 肖 婷， 聂红云， 王 琰

(西安建筑科技大学 环境与市政工程学院，陕西 西安 710055)

铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物对降解烃类的影响作用

黄 璐， 聂麦茜*， 胡 睿， 肖 婷， 聂红云， 王 琰

(西安建筑科技大学 环境与市政工程学院，陕西 西安 710055)

为了研究铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaNY3胞外分泌物对烃类降解的作用，对胞外分泌物影响烃类降解的效率进行了研究。研究发现，NY3菌以LB培养基和以烃类为唯一碳源的无机盐培养基培养得到的种子液，离心并洗涤菌体后，菌细胞代谢烃类效率明显下降。分别利用盐析和溶剂萃取法，提取种子液上清液中胞外大分子和小分子，且投加在NY3菌(离心后的菌细胞)降解十四烷的无机盐培养基中，发现24 h内外加胞外大分子化合物，使NY3菌对十四烷去除率可提高约14%，而投加小分子化合物使NY3菌24 h内对十四烷去除率提高约6%。利用SDS-page聚丙烯酰氨凝胶电泳分离胞外大分子，结果发现主要是该菌胞外所分泌的蛋白或多肽类，主要有3个条带，它们的分子量约在35～55 kD范围内，其对烃降解促进作用机理有待进一步验证。利用飞行质谱(LCMS-IT-TOF)鉴定胞外小分子分泌物，结果表明在本研究条件下，它们均为氧化还原反应活性物，可以加快反应体系中电子传递速度，促进底物的氧化还原反应。

铜绿假单胞菌NY3；胞外分泌物；十四烷；生物降解；物质的鉴定

广泛存在于环境中的烃类污染物对人体健康和生态系统的安全构成了很大威胁。生物修复，尤其是微生物降解，已成为一种最有发展潜力的治理烃类污染的技术[1]。能降解烃类的微生物普遍存在于环境中，且种类繁多[2-3]，如分枝杆菌属、诺卡氏菌属、假单胞菌属、脱硫弧菌属、无色杆菌属。研究发现，假单胞菌属中大多菌株均能降解烃类物质[4]。近年来研究表明，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)有快速降解烃的能力，并在高浓度烃存在下能够快速生长，尤其是对水溶性更小的长链烃[5-7]，这与其丰富的胞外分泌物有密切关系[8-9]。本课题组前期的研究发现，铜绿假单胞菌NY3以单一烃类为唯一碳源生长时，细胞的生长特性常常与种子液接种量密切相关。一般接种量在1%以下，细胞生长速度慢，或根本观察不到细胞的生长趋势。在有些情况下，无菌离心收获细胞后，即使接种量增大，细胞的生长速度也会受很大的影响。据此，我们推测NY3菌细胞生长过程中，胞外分泌物在该菌降解疏水性化合物时，有明显的促进作用。本研究旨在明确铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物及胞外提取物在对其降解烃类物质的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 铜绿假单胞菌NY3(属于假单胞菌属，革兰阴性菌)，本实验室分离并鉴定[10]。

1.1.2 试剂和培养基 无机盐培养基：NH4NO31.0 g，磷酸盐缓冲液(K2HPO4·3H2O 81.22 g，NaH2PO4·2H2O 42.9 g)25 mL，微量元素[11]1 mL，1 mol/L MgSO4·7H2O溶液0.5 mL ，1 mol/L CaCl2·2H2O溶液0.1 mL ，pH 7.5，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃高压水蒸气灭菌30 min，备用。LB培养基：NaCl 5.0 g，牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH调节为7.5左右，121 ℃灭菌30 min，备用。

1.2 方法

1.2.1 NY3种子液的制备 种子液分为两种，分别利用LB培养基和含0.15%(体积分数，下同)十六烷的无机盐培养基制备NY3菌种子液。首先将NY3接种于LB培养基中，30 ℃，150 r/min，好氧培养24 h，OD600达到(1.6±0.05)，备用。无菌条件下，将上述种子液按照10%接种于含0.15%十六烷的无机盐培养基中，30 ℃，150 r/min，好氧培养48 h，OD600达(0.48±0.05)，备用。

1.2.2 种子液胞外分泌物对NY3菌以单一烃类为碳源和能源生长的影响 将上述不同生长条件下获得的种子液，以下面两种不同的方式接种于含0.15%十四烷的无机盐培养基中：①取上述未离心的两种培养基制备的种子液10 mL直接接种于100 mL含十四烷唯一碳源的无机盐体系中；②无菌操作条件下，将两种种子液离心，再用无菌水重悬至离心前相同体积，然后取10 mL接种于相同无机盐体系中。恒温培养，定时采样，用平板计数法测定活菌数(cfu/mL)表示菌体生长量。

1.2.3 种子液胞外分泌物对NY3菌降解正十四烷的影响 按1.2.2中方法在含0.15%十四烷的20 mL无机盐中分别加入2 mL上述离心后与未离心的两种种子液。恒温培养，一定时间间隔取样。用2×5 mL正己烷萃取降解体系中的正十四烷后，定容至10 mL。30 ℃、150 r/min摇床培养。以正十二烷为内标物[12]，用气相色谱法测定，按公式计算烷烃降解率：烷烃降解率(%)=((十四烷初始浓度-色谱测定的剩余含量)/初始浓度)×100%。

1.2.4 种子液中胞外大分子分泌物对NY3菌降解十四烷的影响 分别各取1.2.1中的两种种子液1 000 mL离心去菌，根据盐析的方法[13-14]，加入硫酸铵到两种种子液上清液里，直至溶液饱和。再将溶液离心，收集下层大分子沉淀，用无菌水重悬并定容至2.0 mL，备用。无菌条件下，将一定量的LB种子液离心所得菌体用等体积的无机盐重悬。在20 mL菌悬液中加入0.15%的正十四烷，分别投加2种培养基制备的大分子物质，体积达到 0、8、30、50、60、100 μL。在30 ℃、150 r/min条件下培养，生长24 h时采样，用2×5 mL正己烷萃取降解体系中的正十四烷后，定容至10 mL。以正十二烷为内标物，用气相色谱法测定，按1.2.3中公式计算烷烃降解率。

1.2.5 种子液中胞外小分子分泌物对降解的影响 利用溶剂萃取方法[15]，分别从1 000 mL LB培养基和十六烷无机盐培养基中制备的种子液上清液中提取胞外小分子化合物，收集后，用无菌水定容至2.0 mL，备用。根据1.2.4的投加方式分别将两种小分子加入到20 mL含0.15%的正十四烷菌悬液中。恒温培养，生长24 h时采样，用2×5 mL正己烷萃取降解体系中的正十四烷后，定容至10 mL。以正十二烷为内标物，用气相色谱法测定，按1.2.3中公式计算烷烃降解率。

1.2.6 气相色谱条件 用安捷伦6890N单检测器气相色谱仪(FID检测器)，色谱条件[16]：5% phenyl Methyl Siloxane HP-5毛细管气相色谱柱(30 m×320 μm×0.25 μm)。载气：99.99%高纯氮气。进样口温度250 ℃，分流比50.0∶1。程序升温：初始160 ℃，保留1 min，再以20 ℃/min升温至260 ℃，保留6 min。

1.2.7 凝胶电泳的测定 将1.2.4中提取的大分子用200 μL蒸馏水溶解，取100 μL样品与100 μL 2×样品缓冲液混合,沸水浴中煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，作为样品备用。根据聚丙烯酰氨凝胶电泳法测定[17]。

1.2.8 飞行质谱的测定条件 将1.2.5中提取出的小分子样品溶于甲醇配成浓度100 mg/L的样品，用移液枪将样品注入液相进样小瓶中，用液相色谱-飞行时间质谱联用仪分析。质谱条件：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序：0 min，10%B；1 min，10%B；20 min，90%B；23 min，100%B；23.1 min，10%B。流速：0.2 mL/min,柱温：40 ℃；样品室温度：20 ℃；进样量10 μL。在负离子模式下采集数据，采集范围：100～800 m/z。

2 结果与分析

2.1 LB培养基生长液中分泌物的影响作用

按1.2.2、1.2.3中实验方法，研究离心和未离心LB种子液接种于以十四烷为唯一碳源和能源的无机盐培养基中NY3菌细胞生长特性及去除烃的效率。

从图1A的结果看，NY3菌体细胞生长过程中，以LB培养基生长获得的菌体，将菌体通过离心与胞外液中分泌物分离后，接种于以烃类(十四烷)为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，细胞生长缓慢，细胞生长总量较少。LB培养基中收获的种子液离心后接种于含十四烷的无机盐培养基中，前期(约在0～20 h)NY3菌细胞几乎未生长，后期(约20～53 h)有少量生长，以活菌数(109cfu/mL) 表示的净生长量仅有0.187。而未离心种子液接种后，NY3菌细胞快速生长，在约35 h内净生长量约有0.348，与离心后接种相比，总细胞量提高了4.73倍。随后，继续快速生长，在100 h时，净生长量已经达到0.677，与接种离心后的菌体细胞相比，细胞生长量约提高0.906。图1B结果是平行于图1A所测定的生长体系中十四烷的去除率。图1B中离心或未离心种子液对十四烷去除率差别明显，尤其是随着时间延长差别更大些，与离心种子液相比，接种未离心种子液的体系对烷烃的降解率平均可提高20.89%。

图1 LB种子液胞外分泌物对其以十四烷为碳源生长及代谢特性的影响Fig.1 1Effect of extracellular polymer on the growth and degradation properties by LB medium on tetradecane as carbon sourcesA:LB培养基生长曲线;B:LB培养基降解率A:Growth curves of LB medium;B:Degradation of LB medium

从图1的结果可以看出，NY3菌细胞生长过程中，LB种子液中一定含有一些胞外分泌物，而这些胞外分泌物，在细胞代谢烃类的过程中，起到了一定的促进作用。为了排除是种子液生长过程中未利用的LB培养基中的物质对十四烷降解所起的作用，进行如下实验。

2.2 烃为碳源的无机盐培养基生长液中分泌物的影响作用

从图2A结果看，NY3菌体细胞生长过程中以含烃类(十六烷)的无机盐培养基生长获得菌体，将菌体通过离心与胞外液中分泌物分离后，接种于以烃类(十四烷)为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，细胞生长缓慢，菌体细胞生长的差异性较明显，与图1A结果相似。不同的是，图1A中初始活菌数(109cfu/mL)约为0.44，图2A中初始活菌数(109cfu/mL)约0.11。这是由于十六烷为碳源生长获得种子液的OD600值较小(约为0.56±0.05)，均按10%(体积分数)接种，初始细胞量少则导致图2A中细胞总体生长量较少。但从生长趋势看，仍然可以得出结论，离心种子液时，细胞与上清液中胞外分泌物分离，可导致菌体适应新环境的能力差，生长速度慢，对生长的影响尤其明显的是细胞生长前期。以十六烷为碳源生长获得种子液离心后，细胞适应环境后大约在60 h后，出现快速生长趋势。

图2 十六烷种子液胞外分泌物对其以十四烷为碳源生长及代谢特性的影响Fig.2 Effect of extracellular polymer on the growth and degradation properties by hexadecane medium on tetradecane as carbon sourcesA:十六烷培养基生长曲线;B:十六烷培养基降解率A:Growth curves of hexadecane medium;B:Degradation of hexadecane medium

图2B结果是平行于图2A实验所测定的生长体系中十四烷的去除率。能够看出未离心情况下，生长体系中十四烷去除效率较高。

从图1和图2结果可以看出，NY3菌细胞生长过程中，上清液中含有一些胞外分泌物，而这些胞外分泌物，在细胞代谢烃类的过程中起促进作用。

2.3 大分子物质对NY3菌降解十四烷效率的影响

按照1.2.4方法进行实验，结果如图3所示。

图3 大分子物质对NY3菌降解十四烷效率的影响作用Fig.3 Effect of macromolecule on the degradation of tetradecane by P. aeruginosa NY3

图3中投加8 μL胞外大分子分泌物溶液，相当于接种量为10%种子液中胞外大分子分泌物的量。从图3结果看，外加胞外大分子分泌物，对离心菌体降解十四烷有促进作用。对于投加LB大分子时，投加量为8 μL时，降解24 h十四烷，其去除率可提高1.23%，若投加量增大约4～6倍，去除率可提高7%。胞外分泌物浓度过高(投加超过接种量中胞外大分子分泌物10倍)则会抑制菌体对十四烷的代谢效率。对于投加十六烷大分子时，投加量超过接种溶液中胞外大分子分泌物约4倍以下时，对NY3菌去除十四烷促进作用较小(小于0.1%)，但增加至约6～8倍时，胞外大分子分泌物对菌体降解十四烷的效率有明显促进，24 h内可提高约14%。而投加体积为100 μL时，对十四烷的降解起到了抑制作用。

2.4 小分子物质对NY3菌降解十四烷效率的影响

图4中投加8 μL胞外小分子分泌物溶液，约相当于接种量为10%的种子液中胞外小分子分泌物的量。

图4 投加小分子物质对NY3菌降解十四烷的影响Fig.4 Effect of small molecules on the degradation of tetradecane by P. aeruginosa NY3

从图4 结果看，离心的菌体，外加提取的胞外小分子分泌物对菌体降解十四烷有一定的促进作用。对于投加LB大分子，投加量为8 μL时，降解24 h十四烷，其去除率仅提高约2%，若投加量最大约12倍，去除率可提高6%。同样胞外小分子分泌物过高则对降解起抑制作用。而当投加十六烷小分子时，投加不同量小分子胞外分泌物也得到类似的结果。

图3和图4结果说明，NY3菌细胞生长过程中的胞外分泌物对其代谢烃类物质有促进作用。

2.5 凝胶电泳法对大分子物质的鉴定

按照1.2.7中方法提取胞外聚合物。由于使用盐析法提取胞外聚合物，因此，该聚合物主要是蛋白类物质[19]。利用SDS-page聚丙烯酰氨凝胶电泳分离这些胞外聚合物，结果如图5所示。

从图5结果可见，在两种体系中，NY3菌生长过程中胞外所分泌的蛋白或多肽类化合物主要有3个条带，约在35～55 kD范围内。这几个蛋白条带对NY3菌降解十四烷的促进作用，可能是乳化作用，也可能有一定的催化作用，其作用机理有待进一步验证。

图5 NY3菌细胞生长过程中胞外聚合物(蛋白质)Fig.5 Extracellular polymer secreted by NY3 cells(protein)1:未接种LB培养基；2:十六烷体系种子液上清液；3:LB体系种子液上清液；4：Marker1:No bacteria in LB medium;2:Supernatant of hexadecane seed liquid ;3:Supernatant of LB seed liquid;4：Marker

2.6 飞行质谱法对小分子物质的鉴定

利用飞行质谱法鉴定上述提取出的小分子分泌物， NY3菌分泌的小分子活性物液相色谱分离结果如图6所示。

图6 NY3菌细胞生长过程中胞外小分子分泌物液相色谱分离结果Fig.6 The result about small molecule was identified by the time of flight mass spectrometer

由图6结果可见， NY3菌分泌的小分子化合物为混合物。分别通过一级、二级和三级质谱对图6中各物质进行鉴定,其质谱鉴定结果如表1所示。

表1 利用飞行质谱鉴定出的主要NY3菌胞外小分子化合物

由表1结果可见，NY3菌在两种种子液中生长时，主要的胞外小分子活性物是两种母体环的化合物。其一是吩嗪类环氧化还原活性物质，包括绿脓菌素和吩嗪-1-甲酰胺。另一种小分子化合物母体环则是异咯嗪，包括分子量为244的还原态的异咯嗪和分子量为260的喋啶环，喋啶是由吡嗪和嘧啶并联而成的二杂环化合物，而吡嗪环再并一个苯环，则生成异咯嗪环。异咯嗪的6、7位可被烃基取代生成黄素，是生物体常见的小分子结构片段，有氧化还原活性。异咯嗪中间环单键相连的氮原子上的氢也可以被其他官能团取代，被五碳糖取代(核糖)，则转化成核黄素(一种常见的生物体中的生长素)，同样也有氧化还原反应活性。除表1中所示的能够鉴定的主要小分子活性物外， 保留时间RT 在10.5 ～13.0 min，还发现了一些含量较小的活性小分子物质，同样含有吩嗪结构的环，而在25.0～27.5 min之间也有一些小分子化合物，其结构有待进一步鉴定。

NY3菌在细胞生长过程中，分泌在胞外的小分子活性物质比较丰富，这些小分子活性物都是氧化还原类物质，可以加快电子传递速度，从而促进NY3菌代谢烃的效率。

3 讨 论

分别测定接种了离心的与不离心的LB种子液中十四烷的降解率，说明LB上清液中含有某种对十四烷降解起促进作用的物质。为了排除“是种子液生长过程中未利用的LB培养基中的物质，还是NY3菌细胞生长过程中分泌在上清液中的胞外物所起的作用？”这一疑问，利用十六烷培养基种子液进行了离心接种实验，仍然是未离心接种对十四烷生长代谢的作用明显。由此可知，铜绿假单胞菌 NY3 胞外分泌物对该菌降解烃类物质有一定的促进作用。将提取的胞外大分子和小分子化合物分别投加在降解体系中，结果进一步说明了 NY3 菌胞外大分子和小分子均能不同程度促进该菌体对烃的降解作用。利用SDS-page聚丙烯酰氨凝胶电泳分离胞外大分子，发现主要是该菌胞外所分泌的蛋白或多肽类，在35～55 kD分子量范围内有3个比较明显的蛋白条带。利用飞行质谱法鉴定的胞外小分子分泌物有4种，为绿脓菌素和吩嗪-1-甲酰胺吩嗪属吩嗪类，还有两种为异咯嗪系列化合物，它们均有氧化还原反应活性，可以加快反应体系中电子传递速度，促进底物的氧化还原反应[20]。

本研究对所提取的大分子聚合物通过聚丙烯酰氨凝胶电泳法的鉴定仅仅确定了其分子量的范围，对其具体的物质还可以进行蛋白质、氨基酸测序来进一步确定。

[1] 李永霞, 郑西来, 马艳飞，等. 石油污染物在土壤中的环境行为研究进展[J]. 安全与环境工程，2011,18(4):43-47.

[2] Englert C, Kenzie EJ, Mofizane S, et al. Bioremediation of petroleum products in solid[J].Ann.Arbor..MI,1992.

[3] Harayama S, Kasai Y, Hara A, et al. Microbial communities in oil-contaminated seawater[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2004,15(3):205-214.

[4] Chaerun SK, Tazaki K, Asada R, et al. Bioremediation of coastka oil spill in the Sea of Japan: insolation and characterization of hydrocarbon-degrading bacteria[J].Environment International, 2004,30(7):911-922.

[5] 吴红, 汪薇, 韩双艳, 等. 鼠李糖脂生物表面活性剂的研究进展[J]. 微生物学报, 2007, 34(1): 148-152.

[6] Zhang GL, Wu YT, Qian XP, et al. Biodegradation of crude oil byPseudomonasaeruginosain the presence of rhamnolipids[J]. Journal of Zhejiang University Science, 2005, 6B(8): 725-730.

[7] Ren CY, Nie MQ ,Wang L, et al. Enhancement of Biosurfactant for Biodegradation of Hydrocarbons[J].Environmental science, 2009, 15(4): 44-48(in Chinese).

[8] 堵国成, 陈坚, 陈燕, 等. 石油污染水体的生物修复[J]. 水处理技术，2003,29(5):249-252.

[9] 任春艳, 聂麦茜, 王蕾, 等. 微生物表面活性剂对烃类污染物降解的促进作用[J].环保科技, 2009, 15(4): 44-48

[10]Nie M, Yin X, Ren C, et al. Novel rhamnolipid biosurfactants produced by a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteriumPseudomonasaeruginosastrain NY3[J]. Biotechnology advances，2010,28(5):635-643.

[11]常虹, 聂麦茜, 葛碧洲, 等. 铜绿假单胞菌 NY3 所产表面活性剂对原油降解的影响[J]. 环境工程学报，2013,7(2):771-776.

[12]陈帆, 黄禹, 叶慧. 一种气相色谱定量方法的研究[J]. 温州师范学院学报 (自然科学版)，2000,21(6)：38-39.

[13]戴建英,刘春娇,孙亚琴,等.盐析萃取生物基化学品的研究进展[J].生物工程学报，2013,29(10):1441-1449.

[14]Tang ZG, Zhou RQ, Duan ZT, et al. Separation of isopropanol from aqueous solution by salting-out extraction[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2001, 76:757-763.

[15]杨秀红, 郝军, 孙衍宁, 等. 溶剂萃取法处理炼油厂含酚废水[J].大连轻工业学院学报，2005，24(4)：252-254.

[16]马霞, 聂麦茜, 卢剑, 等. 鼠李糖脂对铜绿假单胞菌 NY3 表面特性及其烃降解效率的影响[J]. 环境科学学报,2014,34(10):2462-2468.

[17]方绍庆，鲁闽，陈克卫, 等. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定动物肌肉蛋白热变性的研究[J]. 现代食品科技，2006,22(3):219-221.

[18]Lars EP, Alexa PW,Petersen A,et al. The phenazine pyocyanin is a terminal signalling factor in the quorum sensing network ofPseudomonasaeruginosa[J]. Molecular Microbiology，2006,61(5):1308-1321.

[19]Markus H , Andreas K,Ochsner UA, et al. Cloning and heterologous expression of a gene encoding an alkane-induced extracellular protein involved in alkane assimilation fromPseudomonasaeruginosa[J]. Journal of environmental microbiology, 1994, 60(10):3679-3687.

[20]Alexa PW, Lars EP, Dianne KN,et al. Pyocyanin Alters Redox Homeostasis and Carbon Flux through Central Metabolic Pathways inPseudomonasaeruginosaPA14[J]. Journal of bacteriology,2007, 189(17): 6372-6381.

Effects of Extracellular Polymer on Alkanes Degradation byPseudomonasaeruginosaNY3

HUANG Lu, NIE Mai-qian, HU Rui, XIAO Ting, NIE Hong-yun, WANG Yan

(Schl.ofEnvironm’landMuni.Engin.,Xi’anUni.ofArchitect&Technol.,Xi’an710055)

The influence of extracellular excretion on degradation rate of hydrocarbon was studied in order to understand the effect of extracellular excretion on hydrocarbon degradation byPseudomonasaeruginosaNY3. It was found in the study that the seed solution of NY3 cultured and grew on LB medium with hydrocarbon as the sole carbon source and inorganic salt, the efficiency of hydrocarbon metabolism of the bacterial cell after centrifuge and wash significantly declined. Extracellular macromolecule and small molecule extracted from seed solution supernatant respectively with salt-outing and solvent extraction was plunged into NY3 cells (the cells after centrifuged) inorganic salt medium for degrading tetradecane, extracellular macromolecule compound was found within 24 h make the depletion rate of tetradecane by NY3 cells to increase by 14%. While the one plunged into NY3 cells within 24 h with small molecule compound within 24 h make the depletion rate of tetradecane by NY3 cells to increase by 6%. Extracellular macromolecules of the NY3 cells were isolated and identified by SDS-page polyacrylamide electrophoresis. It was found that they were proteins or polypeptides, mainly there were bands and their molecular weight is within about the range of 35-55 kD. The enhancement mechanisms of its hydrocarbon degradation remained to be proved further. Small molecule secretion was identified by flight mass spectrometer (LCMS-IT-TOF). The results showed that under the conditions of present experiment, they were all oxidation-reduction active substance that could accelerate the electron transferring rate in the reaction system, to enhance oxidation-reduction reaction of substrate.

PseudomonasaeruginosaNY3; extracellular excretion; tetradecane; biodegradation; identification of substances

国家自然科学基金项目(51278405); 陕西省国际科技合作重点项目(2012KW-25); 2011榆林市产学研项目

黄璐 女，硕士研究生。主要从事持久性有机污染物的生物降解技术研究。E-mail：493939940@qq.com

*通讯作者。女，博士生导师。主要从事持久性有机污染物的生物降解技术研究。E-mail：1489952335@qq.com

2016-04-08；

2016-04-29

Q939.99；X53

A

1005-7021(2017)01-0036-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.01.006