姜黄素对糖尿病脑病大鼠海马PPARγ-ABCA1胆固醇转运体的影响*

田茗源，张 雄，梁 洁，袁 磊△.重庆医科大学附属第二医院 内分泌科(重庆 40006)；2.重庆医科大学 病理学教研室(重庆 40006)；3.重庆市神经生物学重点实验室 (重庆 40006)

·论 著·

姜黄素对糖尿病脑病大鼠海马PPARγ-ABCA1胆固醇转运体的影响*

田茗源1，张 雄2,3，梁 洁2,3，袁 磊1△
1.重庆医科大学附属第二医院 内分泌科(重庆 400016)；2.重庆医科大学 病理学教研室(重庆 400016)；3.重庆市神经生物学重点实验室 (重庆 400016)

目的 观察姜黄素对糖尿病脑病大鼠学习记忆的影响，并探讨姜黄素对海马组织中PPARγ-ABCA1胆固醇转运体的影响。方法 采用STZ诱导法，构建糖尿病脑病大鼠，分为正常组、姜黄素对照组、糖尿病脑病组和糖尿病脑病姜黄素组。STZ腹腔注射诱导建立糖尿病脑病大鼠，糖尿病脑病姜黄素组和姜黄素对照组予以姜黄素60 mg·kg-1.d-1灌胃，持续12周，余大鼠用等量的羧甲基纤维素钠灌胃,连续12周。通过Morris水迷宫，检测各组大鼠的认知功能变化；采用Western blot检测各组大鼠海马部位的PPAR-γ、LXRα、ABCA1的蛋白表达。结果 Morris实验显示：与糖尿病脑病组相比，姜黄素可以明显改善糖尿病脑病出现的认知功能障碍(P<0.05)。糖尿病脑病组PPAR-γ、LXRα、ABCA1的蛋白水平明显低于正常组和姜黄素对照组(P<0.01)，而糖尿病姜黄素组海马中PPAR-γ、LXRα、ABCA1的蛋白水平均高于糖尿病脑病组(P<0.01)。结论 姜黄素可以改善糖尿病脑病引起的认知功能障碍，而该过程可能依赖海马PPARγ-LXRα-ABCA1胆固醇跨膜转运体的激活。

姜黄素；糖尿病脑病；PPARγ；LXR-α；ABCA1

糖尿病脑病主要是由于脑萎缩和大脑电生理改变导致的一系列神经功能丧失的疾病，包括学习、记忆、认知以及精神运动障碍[1]。大量流行学研究[2]表明，无论1型糖尿病还是2型糖尿病，患者到一定程度均表现有一系列神经病理学以及神经行为学的改变，包括：脑梗死、记忆能力、视觉空间能力等障碍。目前，关于糖尿病脑病机制的研究仍不清楚，认为长期的慢性高血糖症、脑血管病变、氧化应激、炎症反应、神经元丢失、胰岛素信号通路失调等均参与糖尿病脑病的发病机制[3-4]。

胆固醇是大脑细胞膜中的主要脂质成分，约占全身总胆固醇量的23%～25%，且能不依赖血液系统而独立合成[5]。在神经系统中，胆固醇在突触的形成、功能以及动作电位的传递过程中均起重要作用[6]。研究[7]发现，脑内胆固醇合成过多可以诱发阿尔茨海默病，也有研究[8]表明，在糖尿病脑病大鼠模型中，大脑和循环系统中胆固醇水平明显增高，提示脑内胆固醇代谢失调在糖尿病脑病的发生发展过程中起重要作用。

近年来，研究[9]发现，ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)跨膜转运胆固醇体系在脑内胆固醇代谢中起重要作用。ABCA1属于调节细胞和组织胆固醇平衡的ABC转运体超家族成员的一员，通过其跨膜通道将不同的脂质分子从细胞内转运到细胞外，从而保护脑内胆固醇的代谢平衡[10]。

姜黄素是一种黄色粉末状物质，为一种植物提取物，其具有抗炎、抗氧化等特征，已被证实对阿尔茨海默病、重型抑郁等神经退行性疾病具有保护作用。研究[11- 12]发现，姜黄素可以明显改善链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病脑病症状，但在此过程中，目前没有研究脑内胆固醇如何代谢。本实验选用STZ诱导法构建糖尿病脑病的大鼠模型，拟研究姜黄素对该模型脑内胆固醇代谢的变化，从而为姜黄素治疗糖尿病脑病提供潜在的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

雄性Sprague-Dawley大鼠，购于重庆医科大学动物中心，均喂养于SPF级动物房。温度保持在(25±1) ℃，每日早上8:00至晚上8:00给予光照，且给予充分的水和食物。姜黄素(Sigma USA)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma USA)；STZ(Sigma USA)；羧甲基纤维素钠(Sigma USA)；鼠抗ABCA1抗体(Abcam，UK)；兔抗LXRα抗体(Abcam， UK)；兔抗PPARγ抗体(Abcam，UK)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.2 动物模型的建立和分组给药

采用两因素析因分组的设计方法，50只Sprague-Dawley雄性大鼠，平均体质量(249.800 ±20.120)g，先进行为期1周的适应性喂养，然后禁食12 h后，随机挑选10只为对照组，单次腹腔注射0.5 mmol/L 的柠檬酸盐缓冲液(pH 4.6)，饲养至12周，随机分为正常组(n=5)和姜黄素对照组(n=5)。剩余40只为模型组，腹腔单次注射0.5%的STZ溶液，剂量为60 mg/kg 。于注射后72 h，取大鼠尾静脉血，测量空腹血糖值，血糖浓度>16.7 mmol/L为糖尿病模型鼠。期间，对照组无大鼠死亡，而模型组有2只大鼠死亡，考虑为血糖过高所引起的死亡。糖尿病模型成功38只，继续给予标准饮食，自由觅水喂养12周，行Morris 水迷宫实验，判断糖尿病脑病是否建模成功，未成功模型8只予以剔除。糖尿病脑病鼠共30只，随机分成糖尿病脑病组(n=10)和糖尿病脑病姜黄素组(n=20)。将姜黄素溶于羧甲基纤维素钠， 姜黄素对照组和糖尿病脑病姜黄素组同时予以姜黄素60 mg.kg-1.d-1,灌胃持续12周。余大鼠用等量的羧甲基纤维素钠灌胃。

1.3 Morris水迷宫行为学测试

进行水迷宫实验的大鼠共40只(正常组5只，姜黄素对照组5只，糖尿病脑病组10只，糖尿病脑病姜黄素组20只)，Morris 水迷宫为4个象限的水池，在第2象限正中有一圆形平台，其低于水面2 cm，水温保持在(25±2) ℃，水及平台均为黑色。每只大鼠每天进行4次训练，每次分别从每个象限的固定点作为入水点，连续训练5 d。观察并记录大鼠爬上平台所需的时间(潜伏期)。第6 天撤掉平台，选择第1象限为入水点，观察并记录大鼠120 s内，在原来第2象限游泳的时间。

1.4 Western blot法检测各组大鼠海马组织蛋白表达

用全蛋白提取试剂盒分别提取各组大鼠海马组织，BCA法测定蛋白浓度，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统电泳，将蛋白转至PVDF膜，通过含0.2%的Tween-20的TBS封闭PVDF膜1 h，然后孵育一抗，4 ℃冰箱过夜，再通过含HRP的二抗孵育，ECL法显影，Quantity One软件分析图片结果。鼠抗ABCA1抗体(1∶1 000 Abcam，UK)；兔抗LXRα 抗体(1∶1 000 Abcam，UK)；兔抗PPARγ抗体(1∶1 000 Abcam，UK)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 姜黄素改善糖尿病脑病大鼠学习和空间记忆能力

随着时间变化，各组逃避潜伏时间不断降低(P<0.001)，且时间和处理因素之间存在交互作用(P<0.001)。糖尿病脑病组逃避潜伏期(43.860±7.440) s，明显高于正常组(9.740±2.470 )s和姜黄素对照组(12.010±3.810)s(P<0.001)，而糖尿病脑病姜黄素组逃避潜伏时间(26.510± 6.870 )s，明显低于糖尿病脑病组(P<0.001)，说明空间学习能力得到改善。第6 天拆掉平台后，记录了每组老鼠在原平台所在象限的停留时间占游泳总时间的比例，结果显示，糖尿病脑病组的时间比例明显低于正常组和姜黄素对照组(P=0.002，P=0.003)；用姜黄素处理后，其比例明显高于糖尿病脑病组(P=0.032)(图1～2)。

2.2 姜黄素对糖尿病脑病海马组织中PPARγ-LXRα- ABCA1通路的影响

Western blot显示，糖尿病脑病组海马组织中的PPARγ和LXRα蛋白表达明显低于正常组和姜黄素对照组(P=0.001，P=0.002)，而在姜黄素处理后，PPARγ和LXRα的蛋白表达水平较糖尿病脑病组明显升高(P<0.001，P<0.001)；与正常组和姜黄素对照组相比，糖尿病脑病组海马组织中ABCA1蛋白含量明显降低(P<0.001)，用姜黄素处理后，大鼠海马组织中ABCA1的含量与糖尿病脑病组相比，明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)(图3)。

注：与正常组比较，*P<0.01；与姜黄素对照组比较，#P<0.01;与糖尿病脑病组比较,**P<0.05

注：A.PPARr蛋白表达；B.LXRα蛋白表达；C.ABCA1蛋白表达；与正常组比较，*P<0.01；与姜黄素对照组比较，#P<0.01;与糖尿病脑病组比较,**P<0.01

3 讨论

胆固醇为细胞膜结构中重要的成分，脑内胆固醇的含量很高，达15～30 mg/g，而其他组织胆固醇在2～3 mg/g[13]。同时，胆固醇在维持细胞完整性和一些特殊功能方面起着重要作用。在神经系统中，胆固醇主要组成神经元细胞膜和轴突髓鞘的重要成分[14]。由于血脑屏障的作用，大脑无法从循环系统中摄取胆固醇，脑内大部分胆固醇均由胶质细胞合成[5]。脑中胆固醇的含量需维持在一定水平，过多的胆固醇对细胞有毒副作用。目前，已知脑内过多的胆固醇的代谢途径主要有：1)由神经元内的胆固醇酰基转移酶1 (ACAT1)酯化生成胆固醇酯储存在细胞内[15]；2)通过胆固醇-24-羟化酶(CYP46A1)催化生成24-羟基胆甾醇(24OHC)，可以直接通过血脑屏障被转出到循环系统[16]；3)通过ABC跨膜转运体，将多余胆固醇转至载脂蛋白APOA1，通过LRP1和SR1B穿过血脑屏障排至血液循环[17]。研究[9]表明，ABCA1跨膜转运体在神经系统中维持脑内细胞内外胆固醇平衡中起着重要作用。

ABCA1在全身广泛表达，通常利用ATP功能来转运与脂质有关的各种分子通过生物膜。脑内ABCA1主要由神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞合成，负责介导星形胶质细胞、小胶质细胞、大脑毛细血管内皮细胞、周皮细胞中的胆固醇向载脂蛋白转运[18]。

ABCA1跨膜转运胆固醇体系在维持细胞内外胆固醇平衡中起重要作用，研究[19]发现，ABCA1受多个因子调控，如：LXR、RXR、PPAR等调控。LXR为一种氧化型固醇激素的核受体，其包括LXRα和LXRβ两种亚型。LXRα仅在肝脏、肾脏、小肠、脾脏、脂肪组织和巨噬细胞中表达很高，而LXRβ在全身各组织广泛表达，而在肝脏和大脑中含量最高[20]。LXR常需与其异物二聚体配体RXR结合，导致异二聚体LXR/RXR的产生，从而增强ABCA1的表达[21]。PPARs激动剂可以通过激活LXR活性，间接上调ABCA1表达。PPARs包括PPARα，PPARβ，PPARγ3种亚型。而PPARγ为该家族中最重要的成员之一，被认为可以调节多个胆固醇转运的基因表达。

近年来的研究[18]发现，脑内胆固醇水平过高会导致 Aβ的沉积，从而加快阿尔茨海默病的发病进程。 而研究[22]表明，使用PPAR激动剂后，能通过上调脑内ABCA1的表达，增加脑内胆固醇的排出，减少Aβ的生成，从而缓解阿尔茨海默病的发病进程。PPAR-ABCA1可能成为治疗阿尔茨海默病新的药物靶点。研究[23]发现，糖尿病脑病大鼠大脑通过24-羟基胆甾醇(24OHC)转运出血脑屏障的胆固醇量大量降低，导致脑内胆固醇含量大量升高。提示增强脑内胆固醇转运，特别是激活脑内ABCA1胆固醇转运体可能是糖尿病脑病的一个治疗靶点。

姜黄素为一种从植物姜黄的根茎中提取的萃取物，为黄色粉末状混合物，具有抗炎症、抗氧化反应、降低胆固醇等作用，目前已经证实姜黄素可以改善糖尿病脑病引起的神经变性反应。为了更好地探讨姜黄素对糖尿病脑病的保护作用及其相关分子机制，以及ABCA1跨膜胆固醇转运体系在该过程中的作用，本实验采用STZ诱导法构建糖尿病脑病的动物模型。Morris行为学实验结果显示：在第6天撤掉平台后，糖尿病脑病组在原平台停留的时间占总游泳时间比例明显低于正常组和姜黄素对照组，而糖尿病脑病姜黄素组在原平台停留的时间占总游泳时间比例明显高于糖尿病脑病组。表明姜黄素可以改善糖尿病脑病导致的认知功能障碍，该实验与之前的研究[11]一致。

本实验中，Western blot检测各组大鼠海马组织 PPARγ、LXRα的结果表明，与正常组和姜黄素对照组相比，PPARγ、LXRα蛋白含量在糖尿病脑病组中的表达明显降低，而用姜黄素处理后PPARγ、LXRα蛋白表达较糖尿病脑病组明显上调。本实验发现糖尿病脑病可以导致海马PPARγ、LXRα表达下调，而姜黄素可以逆转该过程的发生。由于PPAR可以通过LXR间接调控ABCA1的表达，本实验检测了各组大鼠海马组织中ABCA1的表达，结果显示，在糖尿病脑病组中ABCA1 蛋白含量较正常组和姜黄素对照组表达明显降低，而姜黄素处理后ABCA1的表达较糖尿病脑病组又升高。有研究[24]表明，姜黄素可以通过激活PPARγ-LXRα-ABCA1 转运体，促进脂肪细胞中胆固醇中的排出；也有研究[25]表明，姜黄素可以通过激活PPARγ-ABCA1通路促进胆固醇流出。本实验中发现了，姜黄素可以激活糖尿病脑病海马组织中PPARγ-LXRα-ABCA1跨膜胆固醇转运体系。

综上所述，姜黄素可以改善糖尿病脑病引起的认知功能障碍，而该过程可能依赖海马PPARγ-LXRα-ABCA1通路的激活，这将为未来治疗糖尿病脑病诱发的认知功能障碍供新的药物靶点。

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The Effect of Curcumin on Hippocampal PPARγ-ABCA1 Cholesterol Transporter in Rats with Diabetic Encephalopathy*

TianMingyuan1,ZhangXiong2,3,LiangJie2,3,YuanLei1△.

1.DepartmentofEndocrinology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofPathology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 3.ChongqingKeyLaboratoryofNeurobiology,Chongqing400016,China

Objective To investigate the effect of curcumin on the learning and memory of rats with diabetic encephalopathy and the hippocampal PPARγ-ABCA1 cholesterol transporter. Methods The STZ induction was used to build the Sprague Dawley rats with diabetic encephalopathy, who were randomly divided into the normal control group, curcumin control group, diabetic encephalopathy group, and diabetic encephalopathy group with curcumin. After the successful establishment of diabetic encephalopathy rats by STZ, the rats in the diabetic encephalopathy group with curcumin and curcumin control group received the intragastric administration with curcumin 60 mg/kg per day for 12 weeks, while the rats in the other two groups were given the equal volume of sodium carboxymethyl cellulose per day by gavage for 12 weeks. Morris water maze was used to detect the changes of the rats’ cognitive function in each group. Western blotting was used to detect the expression of PPAR-γ, LXR-α, and ABCA1 in the rats’ hippocampus of each group. Results The results of Morris water maze showed that curcumin significantly attenuated the cognitive impairment in the diabetic encephalopathy group (P<0.05). The expressions of PPAR-γ, LXR-α and ABCA1 were significantly lower in the diabetic encephalopathy group than in the normal and curcumin control groups (P<0.01), while they were significantly higher in the diabetic encephalopathy group with curcumin than in the diabetic encephalopathy group (P<0.01). Conclusion Curcumin can improve the cognitive impairment caused by diabetic encephalopathy via activating the hippocampal PPARγ-LXRα-ABCA1 cholesterol transporter.

Curcumin; Diabetic Encephalopathy;PPARγ；LXR-α; ABCA1

*通信作者：国家青年自然科学基金资助项目(NO:81100948)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0919.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.02.002

R587.1

A

△通信作者：袁磊，E-mail：cosmicatom@163.com