宫颈鳞状上皮内瘤变中人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和磷酸化组蛋白H3的表达及意义*

邓 玮 ，姜 歆 ，吕玉宇 ，喻 敏 ，吕 丽 ，罗 慧. 重庆市第五人民医院 病理科(重庆 400062)；2.重庆市人民医院 病理科(重庆 40003)

·论 著·

宫颈鳞状上皮内瘤变中人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和磷酸化组蛋白H3的表达及意义*

邓 玮1，姜 歆2△，吕玉宇1，喻 敏1，吕 丽1，罗 慧1
1. 重庆市第五人民医院 病理科(重庆 400062)；2.重庆市人民医院 病理科(重庆 400013)

目的 研究人乳头状瘤病毒L1(HPV-L1)壳蛋白及磷酸化组蛋白H3(PHH3)在宫颈鳞状上皮内瘤变中的表达及对宫颈病变转归的预测价值。方法 选择2013年1月至2014年7月在重庆市第五人民医院病理科诊断新柏氏液基细胞学(TCT)异常且高危人乳头状瘤病毒(HR-HPV)检测阳性的病例共234例，对入选患者进行宫颈活检，以病理组织学结果作为标准进行分组；同时，检测其HPV-L1壳蛋白、PHH3的表达情况，并进行相关性分析；对其中随访到的103例患者进行HR-HPV转阴分析。 结果 慢性炎症组和CINⅠ组的HPV-L1阳性率高于CINⅡ～Ⅲ组和SCC组(P<0.01)；PHH3阳性率SCC组高于其他3组(P<0.05)，CINⅡ～Ⅲ组高于慢性炎症组和CINⅠ组(P<0.01)，CINⅠ组高于慢性炎症组(P<0.01)；HPV-L1、PHH3表达呈负相关；随访病例CINⅠ和CIN≥Ⅱ患者中，HPV- L1(+)/PHH3(—)组的转阴率高于其他3组。结论 HPV-L1壳蛋白联合检测PHH3可作为诊断及预测宫颈鳞状上皮内瘤变的有效指标。

宫颈鳞状上皮内瘤变；HPV-L1壳蛋白；PHH3

消退、持续存在或发展为更高级别病变甚至浸润癌是宫颈鳞状上皮内瘤变(CIN)转归的3个方向。临床对于轻度宫颈上皮内瘤变(CINⅠ)患者的处理原则是手术、物理治疗或单纯随访。对CINⅠ的年轻患者，应考虑手术治疗是否会增加其后续妊娠并发症的风险；但如果采用单纯随访，则在随访过程中，患者可能会出现焦虑状态或失访率高等情况，而且某些更高级别的CIN病变，即使采用阴道镜下活检也可能会漏检，因此，单纯随访存在一定的医疗风险。而手术治疗是中、重度宫颈上皮内瘤变(CINⅡ～Ⅲ)的首选治疗方案，但术后复发率可达到1%～25%[1]。但是，现有诊断方法无法预测宫颈病变的进展，导致筛查宫颈癌及其癌前病变过程中，存在过度治疗或漏检等问题，因此，临床上迫切需要一种能预测宫颈病变转归的有用指标，协助医生做出判断，为CIN患者选择最恰当的治疗或随访方案。本研究采用免疫组化研究人乳头状瘤病毒L1(HPV-L1)壳蛋白、磷酸化组蛋白H3(PHH3)在各级CIN中的表达情况及其在预测CIN转归中作用，为宫颈病变的诊断提供有效指标，探索更加恰当有效的处理CIN的方案。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013年1月至2014年7月在重庆市第五人民医院病理科诊断新柏氏液基细胞学(TCT)异常且高危人乳头状瘤病毒(HR-HPV)检测阳性的病例共234例，并行宫颈活检，根据活检结果分为4组：慢性宫颈炎组81例、CINⅠ组 67 例、CINⅡ-Ⅲ组75例、鳞状细胞癌组(SCC组)11 例。分别统计HPV-L1 壳蛋白、PHH3在各组中的阳性表达率，并进行相关性分析。根据文献[2]报道，各级CIN患者进行HPV-L1 壳蛋白、PHH3检测后，本试验CINⅠ组、CINⅡ-Ⅲ组锥切术后及SCC组进行子宫颈癌根治术后，随访间隔时间均为6个月，随访第24个月后，以HR-HPV检测结果为本研究病变的转归结局，转归结局包括：HR-HPV(+)、HR-HPV(-)；由于慢性宫颈炎组病人失访率太高，影响判断结果，暂未进行统计。

1.2 试剂与方法

1.2.1 HR-HPV检测 13种高危HPV亚型检测采用上海之江生物科技股份有限公司荧光定量PCR法，并由仪器判读结果。

1.2.2 组织中HPV-L1壳蛋白检测 HPV-L1壳蛋白试剂盒采用美国Advanced公司产品，具体步骤按试剂盒说明书进行，抗原修复后预杂交，在滴加HPV-L1抗体后进行DNA杂交，AEC显色，苏木素复染，中性树胶封片并观察。阴性对照采用PBS液替代一抗。

1.2.3 组织中PHH3蛋白检测 PHH3单抗购于福州迈新公司，免疫组化采用supervision二步法，DAB显色，复染封片，并进行镜下观察。以PBS液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判读

HPV-L1壳蛋白表达在细胞核，组织切片中鳞状上皮细胞核仅有1个及以上红染即诊断为阳性表达；PHH3为细胞核表达，以细胞核中见到棕黄色颗粒分布为阳性 。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 13.0 软件进行数据分析，定性资料采用例数(%)描述，采用2检验；Spearman等级相关研究HPV-L1 壳蛋白、PHH3两变量表达的相关性；检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 各组别宫颈病变组织中HPV-L1和PHH3的表达情况

图1 免疫组织化学法检测 HPV-L1壳蛋白在CIN中的表达(S-P ×200)

注：A.CINⅠ；B.CINⅢ

表1 各组别宫颈组织中HPV-L1和PHH3的表达情况

图2 免疫组织化学法检测 PHH3在CIN中的表达(S-P ×200)

注：A.CINⅠ；B.CINⅢ

2.2 HPV-L1、PHH3表达相关性分析

在各组病变中， HPV-L1与PHH3的表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.210,P=0.001)(表2)。

表2 HPV-L1、PHH3表达相关性分析

2.3 跟踪随访情况

对103例患者进行跟踪随访，各级别CIN患者按HPV-L1和PHH3两种抗体表达情况分4组进行随访，即：HPV-L1(+)/PHH3(-)、HPV-L1(+)/PHH3(+)、HPV-L1(-)/PHH3(+)和HPV- L1(-)/PHH3(-)。其中，CINⅠ患者共52例，各组间HPV转阴率比较，差异有统计学意义(2=23.188，P<0.001)。HPV-L1(+)/PHH3(-)的转阴率高于其他3组，分别与HPV-L1(+)/PHH3(+)、HPV-L1(-)/PHH3(+)、HPV-L1(-)/PHH3(-)比较，差异有统计学意义(2=5.136，P=0.023；2=17.235，P<0.001；2=10.300，P=0.001)。HPV-L1(+)/PHH3(+)组与HPV-L1(-)/PHH3(+)组比较，差异无统计学意义(2=0.982，P=0.322)；HPV-L1(+)/PHH3(+)组与HPV-L1(-)/PHH3(-)组比较，差异无统计学意义(2=0.000，P=1.000)；HPV-L1(-)/PHH3(+)组与HPV-L1(-)/PHH3(-)组比较，差异无统计学意义(2=0.623，P=0.430)。手术患者与未手术患者的转阴率比较，差异无统计学意义(2=0.424，P=0.515)(表3)。由于≥CINⅡ的患者均行手术治疗，且随访到的患者例数较少，暂未行统计学分析，但术后HPV-L1(+)/PHH3(-)组HR-HPV转阴率较高(表4)。

表3 随访CINⅠ组52例患者的HR-HPV 转归情况[n(%)]

表4 随访≥CINⅡ组51例患者术后HR-HPV 转归情况

3 讨论

近年来，研究[3-4]表明，HR-HPV感染的持续存在是宫颈病变恶性进展的最大危险因素，HR-HPV感染通常持续12～18个月，最终被免疫系统清除，大约10%女性未能清除HPV感染，导致持续感染，引起宫颈病变，恶性转化。HPV病毒有3个功能区，而HPV-L1壳蛋白是一种结构蛋白，由晚期转录L1区编码，感染任何1种亚型HPV病毒后都可以表达。当宫颈基底细胞被HPV病毒感染后，随着细胞分化，大量HPV-L1壳蛋白由L1区开始编码，并主要表达在表层细胞；而当病毒DNA整合入宿主细胞DNA中时，HPV-L1壳蛋白表达降低并逐渐缺失[5]。有研究[6-8]发现，HPV-L1壳蛋白是一种免疫蛋白，能使局部区域产生高浓度保护性抗体，因此，HPV -L1壳蛋白成为免疫反应攻击HPV病毒及病毒感染细胞的主要靶位。HPV-L1壳蛋白表达有助于提高机体免疫能力，抑制异常细胞过度增殖，而当其数量减少或缺失时，不能刺激机体的细胞免疫应答，使得异常细胞逃脱免疫监视，从而引起宫颈病变的发展，如果这种缺失持续存在，会导致细胞异常增殖，进而发展为恶性病变。也有研究[6]表明，HPV-L1壳蛋白是HPV疫苗的主要靶抗原，其制成的病毒样颗粒的疫苗能够特异性地防护子宫颈上皮内瘤形成和感染。近年来，有作者[9]对CIN患者进行HPV-L1壳蛋白检测，发现HPV-L1壳蛋白在诊断CINⅡ及以上病变中具有较高灵敏度，其灵敏度可达到80.6%，特异度为60.2%。研究[10]发现，在CIN患者中，HPV-L1阳性者病变更容易自然消退，而阴性者病变更容易进展，且进展的可能性是HPV-L1壳蛋白阳性的3.391倍，HPV-L1的表达情况与CINⅠ和CINⅡ患者的预后进展密切相关。新近研究[11-12]发现，HPV-L1壳蛋白在低级别上皮内瘤变中表达较高，在高级别上皮内瘤变及癌中表达逐渐降低甚至表达缺失。本研究中，随着宫颈病变程度增加，HPV-L1壳蛋白的表达率逐渐下降，该结果与其他学者[11-12]的研究结果相符。因此，目前通过对HPV病毒及HPV- L1壳蛋白生物学功能的了解，检测HPV-L1壳蛋白的表达情况，可以帮助医生分析HPV病毒感染与宿主细胞之间是游离还是整合关系，并可以协助病理医生对CIN程度的判断及预测宫颈病变的进展可能，为临床医生采取合理的方案提供一定的参考价值。

PHH3是新近发现的一种增殖标记，是一种核心组蛋白，在G2期晚期开始表达并在有丝分裂期达到最大值。现 PHH3已被作为核分裂的标记物，并作为肿瘤病理分级的一个重要指标[13]。研究[14-16]表明，在不同类型的肿瘤，如乳腺癌、脑膜瘤、非典型颗粒细胞肿瘤中，用PHH3免疫组织化学染色计数有丝分裂细胞，能够为肿瘤分级提供更加敏感准确的核分裂计数；且PHH3的表达与肿瘤的组织学分级呈正相关，肿瘤分级越高，PHH3的阳性率越高。多项研究[14,17]已经证明，基于PHH3的免疫组化染色计数核分裂和在HE切片上进行标准有丝分裂计数之间有很强的相关性。有作者[18]在对食道鳞状细胞癌研究中发现，PHH3 分裂指数>10的患者，5年生存率远低于 PHH3 分裂指数≤10的患者，提示 PHH3 分裂指数是较好的独立预后因子。 显微镜下主要从细胞极向、细胞异型性、核分裂相所在的层次等方面对CIN病变进行分级，当CIN诊断出现分歧或判断困难时，PHH3作为核分裂的敏感标记物提示核分裂相所在病变的层次，从而协助病理医生准确地对病变进行分级，因此，PHH3可作为CIN分级的一个有用指标。

研究[19]表明，不是所有的CIN都进展为浸润癌，有部分宫颈病变尤其是低度病变有一定的自愈倾向，有60%左右的病变在没有任何干预下可消退，只有15%左右进展为更高级的病变。由于临床不能对病变的进展进行较准确的预测，因此，主要通过手术治疗来处理大部分CIN病变，导致过度治疗及医疗资源的浪费。研究[20]表明，在轻-中度的鳞状上皮病变中，HPV-L1壳蛋白阳性患者比阴性患者更可能消退，而PHH3的表达与肿瘤的组织学分级呈正相关。本研究表明，HPV- L1(+)/PHH3(-) CIN Ⅰ患者其HR-HPV的转阴率高于其他3组，因此，对HPV-L1和PHH3进行联合检测可以帮助临床医生较准确地判断CIN Ⅰ的进展，防止CIN Ⅰ过度治疗。≥CIN Ⅱ患者HPV-L1(-)/ PHH3(+)组其HR-HPV转阴率最低，提示临床医生提高警惕，加强随访，必要时行阴道镜检查以明确诊断，防止漏诊。目前，虽然有多种手段和方法可以用来筛查CIN，但是这些筛查方法存在一定局限性，如何进一步改善筛查方法，降低筛查的负面影响，是近年来研究重点。本研究提示，HPV- L1联合PHH3检测可以协助医生判断宫颈病变的预后，尤其在帮助临床医生制定处理CIN Ⅰ方案时具有较明显的意义。

综上所述，HPV-L1壳蛋白与PHH3联合检测在CIN的诊断及预测其预后中有一定意义，有望成为诊断及预测宫颈病变的有效指标，值得未来加大样本以深入研究。

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A Study of the Expression of HPV-L1 Capsid Protein and PHH3 in Cervical Intraepithelial Neoplasia and its Diagnostic Significance

DengWei1,JiangXin2△,LvYuyu1,YuMin1,LvLi1,LuoHui1.

1.DepartmentofPathology,TheFifthPeople’sHospitalofChongqing,Chongqing400062,China; 2.DepartmentofPathology,ThePeople’sHospitalofChongqing,Chongqing400013,China

Objective To explore the expression of HPV-L1 capsid protein and PHH3 in cervical intraepithelial neoplasia and the predicative value of the prognosis for cervical lesion. Methods The 234 cases diagnosed as the TCT anomalies and HR-HPV-positive from January of 2013 to July of 2014 in The Fifth People’s Hospital of Chongqing were selected in the study and grouped according to the histopathologic results of the cervical biopsy. Meanwhile, the expression of HPV-L1 capsid protein and PHH3 were detected to analyze the correlation, and the HR-HPV-negative rate of the 103 followed cases was also analyzed. Results The positive rates of HPV-L1 in the chronic and CINⅠ groups were significantly higher than the groups of CINII, CINIII and SCC respectively (P<0.01). The positive rate of PHH3 was higher in the SCC group than the other 3 groups respectively(P<0. 05), and it was also higher in the CINⅡ-Ⅲ group than in the chronic and CINⅠ groups respectively (P<0.01), while the positive rate of PHH3 in the CINⅠ group was higher than that in the chronic group (P<0.01). There was a negative correlation in the expression between HPV-L1 and PHH3. The HR-HPV-negative rate was higher in the group of HPV-L1(+)/PHH3(-) than in the other groups among the patients with CINI and CIN≥Ⅱ.Conclusion The combined detection of HPV L1 capsid protein and PHH3 can be used as an effective indicator in diagnosing cervical intraepithelial neoplasia and predicting its prognosis.

Cervical intraepithelial neoplasia; HPV-L1 capsid protein; Phosphohistone-H3

*通信作者：重庆市卫计委医学科研计划项目面上项目(No：20142170)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0919.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.02.018

R737.33

A

△通信作者：姜歆，E-mail：214310756@qq.com