鼻丘及下鼻甲划痕法治疗变应性鼻炎的机制研究*

谢 艳，刘 洋，蒋路云，谢 辉，张勤修△.成都中医药大学附属医院·临床医学院 耳鼻喉科(成都 6007)；.重庆市西南铝医院 儿科(重庆 400046)

·论 著·

鼻丘及下鼻甲划痕法治疗变应性鼻炎的机制研究*

谢 艳1，刘 洋1，蒋路云1，谢 辉2，张勤修1△
1.成都中医药大学附属医院·临床医学院 耳鼻喉科(成都 610072)；2.重庆市西南铝医院 儿科(重庆 400046)

目的 探讨鼻丘、下鼻甲划痕术治疗变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)的机制。方法 对24例持续性AR患者行鼻丘、下鼻甲划痕手术治疗，并于手术前、手术后4周取其下鼻甲鼻黏膜组织各1块，行HE染色、甲苯胺蓝染色及P物质(substance P,SP)免疫组织化学染色。观察鼻黏膜组织的组织形态及以嗜酸性粒细胞浸润为主的炎症病变情况；肥大细胞(MCs)浸润及脱颗粒情况，并计算MCs活化分数；SP免疫组化积分光密度值(IOD )的测定情况。结果 HE染色：手术后以嗜酸性粒细胞浸润为主的炎症病变程度较手术前有一定改善；SP免疫组化积分光密度值测定：手术前后相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；MCs情况：手术前后MCs浸润数量、脱颗粒情况及活化百分数经两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。手术前后SP积分光密度值变化与MCs活化分数变化经相关性检验，存在相关关系(R=0.594)。结论 鼻丘、下鼻甲划痕通过阻断鼻腔黏膜表面C类阳性感觉神经纤维，进而抑制SP的表达水平，降低其对MCs脱颗粒反应的协同作用，减少炎性介质的释放，进而缓解鼻腔黏膜变应性炎症，改善患者的鼻部症状，且SP含量的变化可在一定程度影响MCs的活化比例。

变应性鼻炎；鼻丘、下鼻甲划痕；肥大细胞；P物质

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是个体接触变应原后，由IgE介导，以炎性介质释放为开端，多种免疫活性细胞、炎性介质、细胞因子及神经肽类活性物质共同参与的I型变态反应性疾病，临床上以发作性鼻痒、喷嚏、清涕、鼻塞等为主要症状，是耳鼻喉科的常见病、多发病。Nihlen等[1]调查发现，AR在世界范围内患病率呈上升趋势。ARIA2010年修正指南中也指出AR全球平均发病率约10%～25%[2]。在过去的20年中，我国南京和乌鲁木齐AR发病率分别从2004—2005年的13.3%、24%大幅上升至2008年的30.3%和37.9%[3]。AR是哮喘、慢性支气管炎等下呼吸道炎症的重要诱发因素，其已成为严重影响人体健康的重要疾病。AR常用的疗法主要为缓解症状，以药物治疗为主[4-5]，药物的副作用及不良反应较大, 物理治疗亦未因技术层面的革新而降低黏膜的损害，且治疗费用昂贵给患者带来较大经济负担[6-7]。因此，寻求其他有效的治疗方法成为医务工作者迫切的愿望与需求。成都中医药大学附属医院耳鼻喉科根据鼻腔解剖结构、生理特点，对AR进行鼻丘及下鼻甲划痕手术治疗，发现该法临床疗效满意，为AR的治疗提供了新的临床思路。为在临床行进一步推广，笔者进行了相关机制的初步研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年3月至2016年3月就诊于成都中医药大学附属医院耳鼻喉科的AR患者24例。纳入标准：1)符合持续性AR诊断标准[5]；2)病程至少1年；3)年龄18～65周岁，性别不限；4)近1周来未接受任何与本病相关的其他药物和(或)接受其他相关治疗措施者；5)能独立完成本研究调查问卷者；6)同意参加本次试验并签署知情同意书者。排除标准：1)妊娠或哺乳期、月经期妇女，计划半年内怀孕的妇女；2)接受免疫治疗者；3)先天性鼻畸形、合并有鼻息肉、鼻中隔明显偏曲或慢性鼻-鼻窦炎患者；4)HIV或其他先天性免疫缺陷疾病患者；5)合并其他过敏性疾病，如过敏性紫癜、哮喘等；6)合并严重心脑血管疾病、肝、肾、血液系统疾病或恶性肿瘤、精神病、糖尿病，有出血倾向者；7)未能签署试验知情同意书者。凡具有以上任何一条患者，均予以排除。其中男10例，女14例；年龄24～62(35.61±9.03)岁；病程1～20(7.75±3.00)年，平均5.50年。

1.2 手术方法

所有手术均由同一名医师操作。于鼻内窥镜监视下局部麻醉后，用15号手术刀于双侧鼻丘、双侧下鼻甲行划痕手术。鼻丘行“井”字型划痕，每条划痕长约1～1.5 cm，间隔5 mm；下鼻甲前2/3份游离缘上、中、下行平行划痕3条，长度约2～2.5 cm，间隔5 mm；鼻丘及下鼻甲划痕均深达骨质表面并行局部松解。治疗结束予以含肾上腺素及奥布卡因的棉片压迫止血至无明显渗血，再予以可降解止血绵或可吸收明胶海绵局部填塞，静脉使用抗生素3 d，3 d后吸出止血绵，仅治疗1次(图 1)。

图1 鼻丘及下鼻甲划痕图示注：A：鼻丘；B：下鼻甲

1.3 标本采集

研究标本为经鼻丘及下鼻甲划痕手术的24例AR患者所提供的手术前后的同侧、同部位下鼻甲黏膜组织。手术前标本为手术中获得，手术后标本为手术结束第4周时于患者到院随访复查时获得。

1.4 实验方法

1.4.1 苏木素-伊红(HE)染色 观察鼻黏膜组织形态学，以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润情况及鼻黏膜纤毛、上皮、腺体、血管情况。

1.4.2 SP免疫组织化学染色 观察鼻黏膜组织中神经肽P物质(substance P,SP)的表达，采用计算机图形分析系统监测阳性神经纤维的平均光密度值,进行半定量分析。阳性表达为浅黄色或棕黄色，阴性表达为蓝色，底色为白色，阳性表达主要在细胞浆、细胞膜或间质等。采用麦克奥迪实业集团有限公司生产的BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再分别随机选取3个区域400倍采集图像。采用美国Media Cybernetics公司生产的Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的平均光密度，取3张图像平均光密度的平均值。

1.4.3 肥大细胞(MCs)甲苯胺蓝染色 观察MCs浸润及脱颗粒情况，计算MCs活化分数。在光镜下观察，背景为淡蓝色或无色，MCs胞浆呈蓝色，胞核为无色，胞质中含有粗大的蓝紫色或紫红色颗粒。MCs周围有紫色颗粒或胞膜破裂或呈现爆炸样，均视为脱颗粒的MCs。每张切片选取3个MCs相对集中的400倍视野，对视野中计数MCs总数和脱颗粒数目(包膜出现明显破裂或有颗粒外逸为脱颗粒)，将相应数值平均即为该点400倍镜下局部MCs总数和脱颗粒数目。MCs活化分数(%)=脱颗粒的MCs数/MCs总数×100%。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 手术前后光镜下鼻黏膜组织学观察

1) 阀门计算书中相关数据。阀杆所受的总力矩MΣ=19 042.19 N·m；活塞直径DH=0.42 m；阀杆直径dF=0.12 m；油缸容积VH=0.01 m3；主管内径d1=0.02 m；支管内径d2=0.01 m；油站出油口压力p1=12 MPa；工艺要求的阀门开关时间tR=10 s。

手术前：鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮脱落，纤毛倒伏、消失，黏膜固有层内血管呈扩张性改变，腺体组织明显增生(图2A)，并伴有大量嗜酸性粒细胞及少量淋巴细胞(图3A)。手术后：鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮脱落，部分纤毛倒伏、消失，黏膜固有层内血管呈轻度扩张，腺体组织可见增生(图2B)，并伴有少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞(图3B)，病变程度较治疗前有一定改善。

图2 手术前后100倍光镜下鼻黏膜组织学观察 注：A：手术前；B：手术后

图3 手术前后400倍光镜下鼻黏膜组织学观察 注：A：手术前；B：手术后

2.2 手术前后鼻黏膜组织中SP积分光密度值、MCs浸润及活性观察

光镜下，SP呈色为棕黄色颗粒，成条索状或网状，主要位于鼻黏膜组织中的小血管或腺体周围。手术结束后4周时鼻黏膜组织的SP积分光密度值较治疗前明显下降，差异有统计学意义(P=0.022)(图 4，表1)。AR患者鼻黏膜组织中浸润大量MCs，多在黏膜下血管周围分布(图 5A)。静息的MCs包膜完整，胞质内有大量紫红色颗粒，细胞核为淡蓝色(图5B)。脱颗粒的MCs周围有紫色颗粒或胞膜破裂或呈现爆炸样(图5C)。手术前及手术结束后4周，AR患者鼻黏膜组织中MCs浸润数目、脱颗粒MCs数目及其活性均呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。

检测项目治疗前治疗后 tPSP/IOD0.286±0.0300.271±0.0342.4520.022均野内MCs计数/个15.41±5.6213.88±5.162.1130.046均野内脱颗粒MCs计数/个6.85±2.905.21±2.013.1510.004MCs活化百分数/个0.45±0.110.37±0.142.1660.041

图4 SP免疫组织化学染色(光镜) ×400倍注：A：手术前；B：手术后

2.3 手术前后鼻黏膜组织中SP表达与MCs活化分数变化的关系

手术后鼻黏膜组织中SP积分光密度值及MCs活化分数均呈下降趋势(△SP：0.039 1±0.038 4；△MCs：0.102 6±0.103 3)，相关系数r=0.594(P=0.007)，存在正相关关系，该相关性具有统计学意义。

图5 肥大细胞甲苯胺蓝染色 注： A(光镜):×400倍; B(油镜):×1 000倍;C(油镜):×1 000倍

3 讨论

外科手术在AR的治疗中逐渐占据一席之地，并被写入我国“变应性鼻炎诊断和指南(2015年)”[8]。前期，笔者进行了鼻丘及下鼻甲划痕法治疗AR，结果提示其有助于改善AR鼻炎患者的症状、生活质量及下鼻甲肿胀情况。为进一步从基础方面为其临床运用提供一些科学依据，故进行了相关机制的探讨。本研究发现，其能够改善鼻黏膜组织以嗜酸性粒细胞浸润情况为主的炎症病变，并以目前认为是发现最早、分布广泛，具有扩张血管、增强血管通透性，调节MCs等免疫细胞功能的神经肽SP，以AR免疫源性炎症的初级效应细胞MCs为切入点，探讨鼻丘及下鼻甲划痕法治疗AR可能存在的“神经-免疫-靶部位”通路。

3.1 鼻丘及下鼻甲划痕能下调SP的表达

鼻丘及下鼻甲划痕术对神经肽的调节作用可能是阐明其治疗AR机制的切入点之一，即通过改变感觉神经肽SP的表达，调节鼻腔神经源性炎症。经典的AR发病机制认为AR是一个IgE介导的I型变态反应，但目前研究提示神经源性炎症也是AR发病的重要因素之一[9-10]。近年来的研究发现，参与神经源性炎症的小分子神经肽主要存在于鼻腔的C类感觉神经、副交感神经及交感神经中。依据不同功能，又可分为感觉神经肽、拟交感神经肽、拟副交感神经肽、炎性神经肽4类。其中，感觉神经肽存在于感受伤害性刺激的C类无髓鞘感觉神经纤维，主要有SP、神经激肽B、降钙素基因相关肽等。SP是迄今研究认为发现最早、分布广泛、活性众多的一种神经肽，属速激肽家族；对神经源性炎症具有促发作用，具有调节免疫细胞功能及促进细胞增殖等作用[11]。

鼻腔中分布有大量SP-IR纤维,分泌SP。鼻SP-IR纤维是以SP作为神经介质的一种肽能神经，大量分布于呼吸道的感觉神经末梢，免疫组化定位表明：SP-IR 神经末梢以C 型无髓鞘感觉神经形式分布于鼻黏膜上皮、黏膜下固有层、鼻黏膜下腺体和血管周围，说明下鼻甲及鼻丘亦是SP-IR纤维分布的主要区域；既往研究提示，鼻丘是鼻腔对外界刺激最敏感的部位，下鼻甲是AR的主要效应靶器官，且黏膜下存在独立的微神经节。

因此，本研究选择了对外界刺激最敏感的部位、富含各种神经支配并具有独立微神经节的AR主要效应靶器官，作为治疗的靶点并取得了满意的近期临床疗效，推测鼻丘及下鼻甲的划痕手术可能通过对鼻丘及下鼻甲丰富的末梢神经及下鼻甲深层的微神经节的破坏，从而通过直接或间接途径抑制神经末梢释放的神经肽SP，从而达到对AR神经源性炎症的抑制，缓解鼻部的变应性症状。本研究结果显示：24例患者经鼻丘及下鼻甲划痕手术干预，其下鼻甲黏膜组织中SP表达水平于手术前后比较，差异有统计学意义(P<0.05)，手术后SP表达水平明显低于手术前。研究结果初步表明鼻丘及下鼻甲划痕术通过改变感觉神经肽SP的表达，从而调节鼻腔神经源性炎症。

3.2 鼻丘及下鼻甲划痕可以降低MCs的浸润及活化

鼻丘及下鼻甲划痕术能降低MCs的数量及活性，这可能是其调节AR的免疫机制之一。AR发病过程中，MCs是影响其发生、发展的重要免疫细胞之一，当鼻腔黏膜受到变应原刺激后，MCs通过脱颗粒反应释放大量炎性介质，致使鼻部组织水肿、血管扩张、腺体分泌增加，刺激感觉神经引发连续喷嚏，且其释放的炎性介质促进次级效应细胞的聚集及活化，进一步扩大炎性反应[12]。MCs是一种公认的免疫细胞，是促进变态反应速发相发生发展的主要、关键细胞[13]。

笔者研究发现经鼻丘及下鼻甲划痕治疗的AR患者治疗结束4周后鼻黏膜组织中MCs的数量及活性较治疗前均明显下降，与治疗前相比差异有统计学意义(P<0．05)；表明鼻腔划痕能下调MCs的浸润及其活性，从而改善AR的免疫源性炎症和鼻部症状。

3.3 “神经-免疫-靶部位”通路存在的可能性

1)神经与MCs在结构上有密切联系。研究[14]报道，神经肽SP等活性物质的表达与MCs的浸润呈正相关，二者结构上的密切联系决定了其功能上密切的交互作用；陆佰荣等[15]也证实MCs周围有大量分布的肽能神经纤维，且认为这些神经纤维能够通过对MCs的调节使其再释放SP 等。2)神经肽能促进MCs释放组胺等炎性介质。研究[16]报道，神经肽SP、CGRP等活性物质可激活MCs细胞膜上的钙动员受体，使细胞内钙池对Ca2+释放，使细胞内Ca2+浓度增加至炎性介质释放阈值，引起组胺等炎性介质的释放，加重AR患者鼻腔内的炎性反应。马辑研等[17]通过采用荧光指示剂，Frau-I检测神经肽SP、CGRP刺激大鼠腹腔MCs(PRMC)后其细胞内Ca2+浓度的变化情况，研究发现经神经肽刺激后MCs内Ca2+浓度出现抛物线性变化，同时其变化时间与组胺等炎性介质释放时间基本吻合。3)MCs对神经肽类活性物质的释放有促进作用。神经肽SP、CGRP等活性物质促进MCs脱颗粒反应的同时，MCs脱颗粒反应也对神经肽类活性物质起着调节作用。在MCs脱颗粒反应过程中，有一类具有炎性蛋白作用的酶—类胰蛋白酶会伴随炎性介质同时被释放。此类活性酶促进SP、CGRP等神经介质的释放[18]。

因此，本研究将治疗前后SP与MCs活化百分数变化值进行相关性检验，相关系数R=0.594。统计结果提示二者之间存在较强的相关关系，可以认为SP含量的变化可以在一定程度上影响MCs的活化比例。故笔者推断鼻丘及下鼻甲划痕治疗AR可能通过这样的“神经-免疫-靶部位”通路而实现。

综上所述，可以认为鼻丘及下鼻甲划痕可能通过对鼻腔局部的神经源性炎症抑制进而下调免疫性炎症从而改善鼻黏膜组织中以嗜酸性粒细胞浸润为主的炎症状态，以达到AR患者临床症状的改善。但是否会因为下鼻甲及鼻丘的多种神经纤维分布，而如笔者所认为的鼻腔划痕手术对AR症状的控制始于对神经源性炎症的改善，进而下调免疫源性炎症，最终达到控制靶部位反应的效应，即所谓的“神经-免疫-靶部位”通路效应；亦或者是始于免疫源性炎症的下调，还是分别对二者的直接调节，以及是通过什么具体路径来实现，还有待进一步研究。

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The Mechanism Study of the Amyxis Surgery of Agger Nasi and Inferior Turbinates in Treating Allergic Rhinitis

XieYan1,LiuYang1,JiangLuYun1,XieHui2,ZhangQinxiu1△.

1.DepartmentofOtorhinolaryngology,TeachingHospital&SchoolofClinicalMedicineofChengduUniversityofT.C.M,Chengdu610072,China; 2.DepartmentofPaediatrics,SouthwestAluminumHospitalofChongqing,Chongqing400046,China

Objective To study the mechanism of the amyxis surgery of agger nasi and inferior turbinates in treating allergic rhinitis (AR). Methods The 24 patients with persistent AR received the amyxis surgery of agger nasi and inferior turbinates. The samples of nasal mucosa were collected before operation and 4 weeks after operation respectively and stained via hematoxylin-eosin (HE) staining, toluidine blue staining and SP immunochemistry staining. The organization form of nasal mucosa tissues and the inflammatory lesions of the infiltration of eosinophilic granulocyte were observed, and the infiltration and degranulation of mast cells were detected and the activated fraction was calculated. The integral optical density (IOD) of immunochemistry was determined. Results The results of HE staining showed that the inflammatory lesions of the eosinophils infiltration after operation were better to some extent than before operation. The results of IOD determination showed significant differences between before and after operation (P<0.05). There were also significant differences between before and after operation in the infiltration quantity and degranulation of mast cells and the activated fraction (P<0.05). The results of the correlation test showed that there were strong correlation between the changes of IOD and the activated fraction of mast cells (R=0.594). Conclusion The amyxis surgery of agger nasi and inferior turbinates can alleviate the allergic inflammation of nasal mucosa and improve patients’ nasal symptoms by blocking the C positive sensory nerve fibers on the surface of nasal mucosa, inhibiting the expression of SP, and reducing the synergetic effect of the response to MC degranulation and the release of inflammatory mediators. Meanwhile, the content changes of Substance P influence the activated fraction of mast cells to some degree.

Allergic rhinitis; Amyxis surgery of agger nasi and inferior nasal concha; Mast cell; Substance P

*通信作者：国家自然科学基金面上项目(No：81472523)；十二五国家科技支撑计划(No：2015BAI04B00)；成都中医药大学科技发展基金(No：ZRQN1621)

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170327.1000.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.02.009

R765.22

A

△通信作者：张勤修，E-mail：zhqinxiu@163.com