当归挥发油对自发性高血压大鼠miR-155及其靶基因的影响

纪禄风，石向慧，王立红，伊 琳*

·论著·

当归挥发油对自发性高血压大鼠miR-155及其靶基因的影响

纪禄风1,2，石向慧1，王立红1，伊 琳1*

目的 探究当归挥发油对自发性高血压大鼠(SHR)miR-155及其靶基因的影响，并从肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)探讨当归挥发油对SHR血压的改善作用及其机制。方法 2015年10月—2016年4月，将8周龄48只SPF级雄性SHR随机分为模型组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组，各8只；另选取8只SPF级正常血压雄性Wistar大鼠作为正常组。正常组、模型组不给予任何药物，当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠分别灌胃给予当归挥发油乳剂12.6 mg·kg-1·d-1、37.0 mg·kg-1·d-1、100.0 mg·kg-1·d-1，藁本内酯溶液0.8 mg·kg-1·d-1，缬沙坦溶液51.4 mg·kg-1·d-1，连续给药4周，给药期间各组大鼠标准饮食、自由饮水。检测给药前及给药第1、2、3、4周各组大鼠收缩压变化。灌胃4周后处死大鼠取心脏，HE染色观察心肌组织病理学的变化，采用Western blotting法检测血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平。采用RT-qPCR法检测miR-155表达水平。结果 不同处理情况、时间在大鼠收缩压中存在交互作用(P<0.05)；不同处理情况、时间在大鼠收缩压中主效应显著(P<0.05)。给药前及给药第1、2、3周，模型组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均高于正常组(P<0.05)；给药第4周模型组大鼠收缩压高于正常组(P<0.05)；给药前当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均高于模型组，给药第1、2、3、4周当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均低于模型组(P<0.05)。HE染色显示，模型组大鼠心肌组织红细胞多而挤，心肌横纹不清，提示心肌充血，右心功能受损；当归挥发油低、中、高剂量组大鼠心肌组织出现横纹且清晰。当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平均低于模型组(P<0.05)。7组大鼠miR-155表达水平比较，差异无统计学意义(P0.05)。结论 当归挥发油能够明显抑制AT1R基因的表达，通过调节ERK1/2信号通路从而达到降压的功能；当归挥发油不通过miR-155在心肌组织发挥作用。

高血压；当归挥发油；miR-155；血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂

纪禄风，石向慧，王立红，等.当归挥发油对自发性高血压大鼠miR-155及其靶基因的影响[J].中国全科医学，2017，20(9)：1055-1060.[www.chinagp.net]

JI L F,SHI X H,WANG L H，et al.Effect of angelica naphtha on the expression levels of miR-155 and target genes in spontaneously hypertensive rats[J].Chinese General Practice，2017，20(9)：1055-1060.

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是广泛分布在人体的一类内源性非编码RNA，一直是医学、生物学研究的热点[1]。miRNA作为一类非编码的小RNA，其参与基因的转录和表达，对靶基因的作用主要是进行基因转录后的调控，能够调节细胞的发育、分化、增殖和组织发育的基因表达。miRNA在基因表达上具有保守性、时空特异性和组织特异性，其对基因的调控极为广泛，一个miRNA可对多个靶基因的表达进行调控，而多个miRNA也可以对一个靶基因的表达进行唯一调控，且miRNA在基因调控和表达方面发挥着不可替代的作用[2]。高血压是以多因素为基础的复杂性疾病，miRNA在高血压的发生、发展中起重要作用，包括对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的过激反应、血管内皮功能的紊乱、血管平滑肌的影响。miR-155是一个典型的多功能miRNA，到目前为止，越来越多的实验表明miR-155参与了高血压的发生、发展过程[3]。当归(angelica sinensis diels)是中国传统中药，也是甘肃的地道药材，尤以甘肃省岷县当归品质最佳。《神农本草经》谓之“当归味温，主呃逆上气”被列为中品，具有补血、和血、调经止血、润肠滑肠之功效，为医家常用，素有“十方九归”之称。有研究发现，当归具有一定的降压作用[4]。本研究旨在通过动物实验研究，从RAAS探讨当归对miR-155及其靶基因和相关信号通路的影响。

本研究背景：

高血压是我国常见的多发病，以遗传和环境因素为主要原因，但是遗传和环境因素通过何种途径升高血压，至今无统一认识，目前认为导致血压升高的机制有：激素机制、神经机制、血管机制、肾脏机制及胰岛素抵抗机制。微小核糖核酸(miRNA)在高血压的发生、发展中起重要的作用，包括对肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过激反应、血管内皮的功能紊乱、对血管平滑肌的影响。miR-155是一个典型的多功能miRNA。到目前为止，越来越多的实验证据表明miR-155参与了高血压的发生发展过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物 48只SPF级雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)，8周龄，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司,动物合格证号SCXK(京)2012-0001，动物检疫合格证明NO.1100562901。8只SPF级正常血压雄性Wistar大鼠，体质量180～220 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号SYXK(甘)2011-0001。

1.2 实验药物与试剂 当归购自甘肃省岷县，采用超临界二氧化碳(CO2)萃取法，由甘肃中医药大学科研实验中心提取当归挥发油(藁本内酯含量75%)，藁本内酯由上海柏卡化学公司提供。缬沙坦分散片(北京诺华制药有限公司，国药准字H20040217)，血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)抗体(北京博奥森生物有限公司)，细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)(Immunoway,货号YT1625)，miR-155引物(易锦生物，货号RmiRQ9003)，RT-qPCR仪(BIO-RAD，货号SORVALL TENSCO)，高效RIPI裂解液(Solarbio，货号R0010)，BCA浓度测定试剂盒(Solarbio)，聚丙酰胺配胶试剂盒(Solarbio)，Western blotting仪(BIO-RAD)，Power Lab ML125/R无创尾动脉血压器(澳大利亚 AD Instruments公司)。

1.3 方法

1.3.1 研究时间 2015年10月—2016年4月。

1.3.2 分组和给药 SHR和Wistar大鼠于SPF级动物房适应性饲养1周后，于给药前测定大鼠血压，采用Power Lab ML125/R无创尾动脉血压器测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压，连续测量1周。待大鼠血压平稳后，将SHR随机分为模型组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组，各8只；Wistar大鼠作为正常组。正常组、模型组不给予任何药物。当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组根据实验鼠体表面积最终确定给药剂量，分别灌胃给予当归挥发油乳剂(吐温-80助溶)12.6 mg·kg-1·d-1(含1%当归挥发油)、37.0 mg·kg-1·d-1(含5%当归挥发油)、100.0 mg·kg-1·d-1(含10%当归挥发油)，藁本内酯溶液(吐温-80助溶)0.8 mg·kg-1·d-1，缬沙坦溶液51.4 mg·kg-1·d-1，1次/d，每周给药7 d，连续给药4周，并随着大鼠体质量变化每周按时调整给药剂量。每周第7天同一时间点测量大鼠尾动脉血压，每只大鼠测量血压5次，取平均值记录。给药期间各组大鼠标准饮食、自由饮水。

1.3.3 样本采集及检测方法

1.3.3.1 心脏标本的制备 给药4周后将各组大鼠禁食、不禁水12 h，按照其体质量不同分别采用3%水合氯醛(避光)腹腔注射，麻醉后颈椎脱臼处死，开胸取出心脏，10%甲醛溶液固定，石蜡组织包埋及HE染色，观察心肌组织病理学切片变化。

1.3.3.2 Western blotting法检测心肌组织AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平 各组大鼠处死后取心肌组织50 mg，PBS冲洗后，加0.5 ml高效RIPI裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4 ℃下13 000 r/min离心10 min(离心半径12.5 cm)，取上清液，95 ℃水浴10 min，同时采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，根据蛋白浓度计算上样量，而后采用Western blotting法检测AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2，以GAPDH作为内参照进行半定量分析，记录AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平。

1.3.3.3 RT-qPCR法检测心肌组织miR-155表达水平 取各组大鼠心肌组织50 mg，DEPC冲洗后，按Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度计测其纯度与浓度，其中OD260/OD280在1.8～2.0代表其纯度较好；采用1%琼脂糖变形凝胶电泳检测RNA的完整性。提取总RNA后，采用颈环结构的MegaPlexTMRNA反转录引物混合物进行反转录，反转录结束后按照miRNA RT-PCR反应体系进行扩增，以U6作为内参照，进行PCR产物的半定量分析。U6上游引物：5′-GCCCGATCTTGTCTGATCTC-3′，下游引物：5′-CCTGACCCTGCTTAGCTTCC -3′；miR-155上游引物：5′-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGT-3′，下游引物：5′-GCGGCTTAATGCTAATTGTGATA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s,75 ℃延伸30 s，75 ℃终极延伸1 min，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-155表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠给药前后收缩压比较 不同处理情况、时间在大鼠收缩压中存在交互作用(P<0.05)；不同处理情况、时间在大鼠收缩压中主效应显著(P<0.05)。给药前及给药第1、2、3周，模型组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药第4周模型组大鼠收缩压高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药前当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均高于模型组，给药第1、2、3、4周当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 各组大鼠心肌组织病理学情况 正常组大鼠心肌组织红细胞正常，细胞核大小、染色正常，心肌横纹清晰。模型组大鼠心肌组织红细胞多而挤，细胞核浓缩、染色变深，心肌横纹不清，提示心肌充血，右心功能受损。当归挥发油低剂量组大鼠心肌组织红细胞可见细胞核深染、清晰，核膜清晰，心肌横纹清晰。当归挥发油中剂量组大鼠心肌组织红细胞可见细胞核浓缩程度减轻，心肌横纹稍清晰。当归挥发油高剂量组心肌横纹明显，毛细血管呈深红色。藁本内酯组、缬沙坦组大鼠与正常组大鼠心肌组织红细胞形态无异。各组大鼠心肌组织均未见明显的纤维化(见图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

2.3 各组大鼠AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平比较 7组大鼠AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图2)。

2.4 各组大鼠miR-155表达水平比较 7组大鼠miR-155表达水平比较，差异无统计学意义(P0.05，见表3)。

表1 各组大鼠给药前后收缩压比较

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05;1 mm Hg=0.133 kPa

注：A～G分别为正常组、模型组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组

图1 各组大鼠心肌组织病理图(HE染色，×400)

Figure 1 Pathological changes in myocardial tissue in the all groups

注：AT1R=血管紧张素Ⅱ1型受体，ERK1/2=细胞外调节蛋白激酶1/2，p-ERK1/2=磷酸化ERK1/2

图2 各组大鼠AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白电泳图

Figure 2 Electrophoretic pattern of AT1R,ERK1/2,p-ERK1/2 proteins in the all groups

Table 2 Comparison of expression levels of AT1R,ERK1/2 and p-ERK1/2 in the all groups

组别AT1RERK1/2p-ERK1/2正常组0.22±0.040.40±0.110.50±0.13模型组0.34±0.030.45±0.120.85±0.32当归挥发油低剂量组0.14±0.01a0.41±0.14a0.51±0.15a当归挥发油中剂量组0.13±0.02a0.36±0.08a0.30±0.09a当归挥发油高剂量组0.14±0.02a0.34±0.09a0.24±0.05a藁本内酯组0.12±0.02a0.27±0.04a0.34±0.07a缬沙坦组0.07±0.01a0.29±0.03a0.21±0.06aF值5.3305.02676.840P值0.0050.006<0.001

注：AT1R=血管紧张素Ⅱ1型受体，ERK1/2=细胞外调节蛋白激酶1/2，p-ERK1/2=磷酸化ERK1/2；与模型组比较，aP<0.05

Table 3 Comparison of expression level of miR-155 in the all groups

组别miR-155正常组1.00±0.00模型组0.90±0.17当归挥发油低剂量组1.01±0.15当归挥发油中剂量组1.07±0.32当归挥发油高剂量组0.96±0.24藁本内酯组0.86±0.16缬沙坦组0.78±0.22F值0.580P值0.720

3 讨论

原发性高血压病是心脑血管疾病的危险因素，常引起心、脑、肾等重要靶器官损伤。miRNA于1993年被发现，随着表观遗传学的发展，miRNA与高血压的联系逐渐被探究，尤其是miR-155[1]。因此，本研究通过动物实验，从RAAS角度观察当归对miR-155及其靶基因和相关信号通路的影响，为高血压治疗提供新靶点。

在既往研究中，本课题组发现当归挥发油可对SHR大鼠的心、脑组织表达谱产生影响，且均与信号转导通路有关[5-6]。当归作为祖国传统中药，在防治高血压的发生、发展中起一定作用，其主要通过作用于RAAS、离子通道、血管、神经等途径对原发性高血压病发生作用。miR-155已经证明与RAAS有关[7-12]。RAAS通过影响心脏收缩力、血管阻力、血容量在机体血压调节方面发挥重要作用。AT1R是AngⅡ最重要的受体，YANG等[7]研究表明，AT1R可被过表达的miR-155抑制,miR-155通过调控AT1R的表达而参与高血压的发生、发展，其在很大程度上对血压有负反馈的作用，同时也证实了AT1R基因是miR-155的靶基因。miR-155位于21号染色体上，21号染色体若出现三体化，常导致血压降低。有研究显示，同卵双胞胎21三体综合征患者中，AT1R表达水平降低，miR-155表达水平上调，说明miR-155可通过调控21号染色体而影响血压，且miR-155与血压呈显著负相关[8]。另有研究显示，成年SHR主动脉miR-1、miR-155、miR-208表达水平与血压呈负相关，提示其可能参与高血压的发生、发展，其中miR-155可作用于AT1R基因抑制Hat1 RNA的表达，而此种表达还可以通过生理刺激进行调节[9]。另一方面，有研究构建miR-155的质粒表达载体，配合外源性AngⅡ作用于人类脐静脉内皮细胞，发现外源性AngⅡ激活ERK1/2影响血管内皮细胞迁移和新生，而导入miR-155的细胞则可以抑制外源性AngⅡ诱导ERK1/2的激活，减少AngⅡ的压力刺激[10]。而转染miR-155的反义核苷酸时，AT1R的表达水平和ERK1/2的活性均明显增高[11-12]。本研究结果还显示，当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠AT1R、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平均低于模型组。

本研究结果显示，当归挥发油并不能使心肌组织miR-155表达水平发生明显变化，但可通过下调RAAS的AT1R基因使AngⅡ的升压功能得到抑制，并能抑制ERK信号通路，从而达到降压的效果。因此笔者推测，在既往对SHR的研究中，miR-155能在内皮组织或细胞中特异性表达，但并未提及在心肌组织的检测，在SHR的心肌组织中miR-155并不是特异性表达的miRNA，心肌组织的AT1R基因主要受RAAS调节，与miR-155无关[7-8]。这与本课题小组前期的芯片检测结果相吻合[5-6]。本研究结果显示，给药前及给药第1、2、3周，模型组、当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均高于正常组；给药前当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均高于模型组；给药第1、2、3、4周当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、藁本内酯组、缬沙坦组大鼠收缩压均低于模型组；虽然当归挥发油能降低SHR的血压，但HE染色发现所有组未出现明显的心肌组织纤维化，因此，本课题组推测，由于SHR 8周龄前血压开始升高,24周心肌纤维化开始明显，而本实验的SHR 15周龄时才被取材，故HE染色观察时只提示右心功能受损，并未出现明显的心肌纤维化。

本研究发现当归挥发油对SHR有降压作用，同时发现藁本内酯的治疗亦有效，笔者推测当归挥发油可能通过藁本内酯发生作用。因此后续研究中本课题组会对藁本内酯进行药效学研究，同时对当归挥发油的其他成分进行验证，以确定当归挥发油的降压机制和降压作用的最终成分，明确miR-155特异性表达的组织，最终阐明当归挥发油通过miR-155抑制其靶基因调节RAAS降压的机制。

综上所述，当归挥发油的降压机制是抑制AT1R基因的表达，通过调节ERK1/2信号通路从而达到降压的功能。当归挥发油不通过miR-155在心肌组织发挥作用，这与本课题组预期的结果相一致。本课题组证实了当归挥发油对RAAS的降压作用，也发现藁本内酯的降压作用，这对以后研发当归的药效学意义重大。

作者贡献：纪禄风进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；石向慧、王立红进行实验实施、评估、资料收集；伊琳进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Effect of Angelica Naphtha on the Expression Levels of miR-155 and Target Genes in Spontaneously Hypertensive Rats

JILu-feng1,2,SHIXiang-hui1,WANGLi-hong1,YILin1*

1.SchoolofIntegratedChineseandWesternMedicine,GansuUniversityofChineseMedicine，Lanzhou730000,China2.KeyLaboratoryofIntegratedChineseandWesternMedicine,GansuUniversityofChineseMedicine，Lanzhou730000,China

*Correspondingauthor:YILin,Associateprofessor;E-mail：yxxxlyyy@163.com

Objective To study the effect of angelica naphtha on the expression levels of miR-155 and target genes in spontaneously hypertensive rats(SHR),and to investigate the influence and mechanism of action of angelica naphtha on lowering the blood pressure in SHR from the perspective of renin angiotensin aldosterone system(RAAS).Methods This study was conducted between October 2015 and April 2016.We randomized 48 SPF male SHR rats aged 8 weeks old into model group,low-dose angelica naphtha group,medium-dose angelica naphtha group，high-dose angelica naphtha group,ligustilide group,valsartan group with 8 SHR rats in each group,and selected 8 SPF male Wistar rats with normal blood pressure as the normal group.Low-dose angelica naphtha group,medium-dose angelica naphtha group，high-dose angelica naphtha group,ligustilide group,valsartan group were given intragastric administration of angelica naphtha emulsion 12.6 mg·kg-1·d-1,37.0 mg·kg-1·d-1,100.0 mg·kg-1·d-1,ligustilide solution 0.8 mg·kg-1·d-1,valsartan solution 51.4 mg·kg-1·d-1,respectively,once a day,for 4 weeks,while both the normal group and model group were not given any drugs during this period.All the groups had standard diet,and they could drink water freely during this period of intervention.Systolic blood pressure(SBP) was measured in each group before the intervention,at the 1st,2nd,3rd,and 4th weeks of intervention.All the rats were sacrificed and the heart was taken at the end of intervention.HE staining was used to recognize the morphologic changes in cardiac tissue.Western blotting was employed to determine the expression levels of angiotensin Ⅱ type 1 receptor(AT1R),extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2) and phosphorylated ERK 1/2(p-ERK1/2).And RT-qPCR was adopted to measure the expression level of miR-155.Results There was interaction on SBP in rats among different treatment ways and time(P<0.05).There was significant effect on SBP in rats among different treatment ways and time(P<0.05).Before the intervention,and at the 1st,2nd,3rd weeks of intervention,the SBP was lower in the normal group than in other groups(P<0.05).The 4th week of intervention,the SBP in model group was higher than nomal group(P<0.05).The SBP was lower in the model group than in other groups except the normal group before the intervention(P<0.05),while it was higher in the model group than in other groups except the normal group at the 1st,2nd,3rd,4th weeks of intervention(P<0.05).HE staining showed that,the model group had unclear myocardial stripes with erythrocytes crowded in the cardiac tissue,which suggested that myocardial hyperemia and right ventricular dysfunction occurred in the group;low-dose,medium-dose，and high-dose angelica naphtha groups had clear myocardial stripes.The model group had higher expression levels of AT1R,ERK1/2,and p-ERK1/2 than low-dose,medium-dose，and high-dose angelica naphtha groups,ligustilide group,and valsartan group(P<0.05).The expression level of miR-155 did not differ significantly between all the groups(P0.05).Conclusion Angelica naphtha could significantly inhibit the expression of AT1R gene;by adjusting the ERK1/2 signaling pathway,it could lower the blood pressure;it did not affect the cardiac function via the expression of miR-155.

Hypertension；Angelica naphtha；miR-155;Angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers

国家自然科学基金资助项目(81460669)——基于miRNA与RAS系统探讨当归降压的分子机制研究；甘肃省自然科学基金资助项目(1310RJZA084)——当归提取液对自发性高血压大鼠miRNA差异表达谱的影响

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.09.007

2016-11-23；

2017-02-01)

1.730000甘肃省兰州市，甘肃中医药大学中西医结合学院

2.730000甘肃省兰州市，甘肃中医药大学中西医结合重点实验室

*通信作者：伊琳，副教授；E-mail：yxxxlyyy@163.com