镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠酪酪肽表达的影响

金 华,刘志军,张秋菊,颜春鲁,刘峰林,陈 丽,徐厚谦,胡继宏,窦荣海,温鑫洋,曹 强,苏莉莉

·论著·

·中医·中西医结合研究·

镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠酪酪肽表达的影响

金 华1,2*,刘志军1,张秋菊1,颜春鲁1,刘峰林1,陈 丽1,徐厚谦1,胡继宏1,窦荣海1,温鑫洋1,曹 强1,苏莉莉1

目的 探讨镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠(SHR)酪酪肽(PYY)表达的影响。方法 2012年6月—2015年4月选取14周龄雄性SHR 75只，随机分为模型组(n=15)、贝那普利组(盐酸贝那普利灌服0.90 mg·kg-1·d-1，n=15)、镇肝熄风汤低、中、高剂量组(镇肝熄风汤分别灌服15、30、60 g·kg-1·d-1，n=15)，以WKY大鼠15只作为WKY组，模型组及WKY组每日灌服同体积的蒸馏水。干预8周后，实验过程中WKY组大鼠死亡6只，模型组大鼠死亡6只，贝那普利组大鼠死亡7只，镇肝熄风汤高剂量组大鼠死亡6只，镇肝熄风汤中剂量组大鼠死亡6只，镇肝熄风汤低剂量组大鼠死亡6只应用酶联免疫实验法检测各组大鼠血清PYY水平，采用免疫组化法检测结肠组织PYY水平，RT-PCR法检测结肠组织PYY mRNA水平。结果 模型组血清PYY水平高于WKY组(P<0.05)；镇肝熄风汤高剂量组血清PYY水平低于模型组(P<0.05)。模型组结肠组织PYY 水平高于WKY组(P<0.05)；贝那普利组和镇肝熄风汤高、中、低剂量组结肠组织PYY水平低于模型组(P<0.05)；镇肝熄风汤高剂量组结肠组织PYY水平低于贝那普利组(P<0.05)。模型组结肠组织PYY mRNA水平高于WKY组(P<0.05)；贝那普利组和镇肝熄风汤高、中剂量组结肠组织PYY mRNA水平低于模型组(P<0.05)；镇肝熄风汤高剂量组结肠组织PYY mRNA水平低于贝那普利组(P<0.05)。结论 SHR结肠组织PYY调节失衡，镇肝熄风汤可能通过调节PYY的表达而达到降压目的。

大鼠，近交SHR；镇肝熄风汤；酪酪肽

金华,刘志军,张秋菊，等.镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠酪酪肽表达的影响[J].中国全科医学，2017，20(9)：1093-1097.[www.chinagp.net]

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近年来，胃肠激素与血压调控的关系受到医学界的广泛关注[1-2]。酪酪肽(PYY)是由36个氨基酸组成的小分子多肽，由分布在肠道远端的内分泌L-细胞分泌，是一种重要的胃肠激素类脑肠肽，而有关PYY在高血压发病过程中的表达及镇肝熄风汤对其的影响目前尚缺乏相关研究。前期研究显示，镇肝熄风汤可明显降低自发性高血压大鼠(SHR)血压[3]，本实验旨在继续探讨镇肝熄风汤对SHR PYY水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2012年6月—2015年4月选取14周龄雄性SHR 75只，SPF级，体质量(350±20)g，同源雄性WKY大鼠15只，SPF级，体质量(335±15)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001；均饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验室，恒温(22±2)℃，恒湿(55±5)%，人工光照明暗各12 h。

1.2 实验分组及干预方法 75只SHR常规饲养7 d后，随机分为5组：模型组，贝那普利组，镇肝熄风汤低、中、高剂量组，每组15只；同时以WKY大鼠15只作为WKY组。以蒸馏水为溶剂配制盐酸贝那普利混悬液(蒸馏水和盐酸贝那普利的比例为10 ml∶9 mg)，贝那普利组灌服盐酸贝那普利混悬液0.90 mg·kg-1·d-1；参照文献[4]，镇肝熄风汤低、中、高剂量组分别灌服镇肝熄风汤15、30、60 g·kg-1·d-1。模型组及WKY组灌服蒸馏水10 ml·kg-1·d-1。各组均干预8周。实验过程中WKY组大鼠死亡6只，模型组大鼠死亡6只，贝那普利组大鼠死亡7只，镇肝熄风汤高剂量组大鼠死亡6只，镇肝熄风汤中剂量组大鼠死亡6只，镇肝熄风汤低剂量组大鼠死亡6只。

1.3 药物、试剂和仪器

1.3.1 药物 镇肝熄风汤按张锡纯《医学衷中参西录》药物组成和剂量制备(1两=30 g,1钱=3 g)，由牛膝30.0 g、代赭石30.0 g、龙骨15.0 g、牡蛎15.0 g、龟甲15.0 g、(杭)白芍15.0 g、玄参15.0 g、天冬15.0 g、川楝子6.0 g、麦芽6.0 g、茵陈6.0 g、甘草4.5 g组成，药物由甘肃中医药大学附属医院提供。代赭石、龙骨、牡蛎、龟甲先煎2 h，然后与其他药物混合用8倍蒸馏水常规煎煮3次，过滤，浓缩，置于4 ℃冰箱中保存，备用。盐酸贝那普利(洛汀新，10 mg,北京诺华制药有限公司，批号X1936)。

1.3.2 试剂 PYY 酶联免疫吸附实验(ELISA)测定试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号20130402B)。PYY一抗，批号ab15879，批次(Lot)：147843-1；山羊抗兔IgG(H+L)〔Goat anti-Rabbit IgG(H+L)〕，ab6702；均购于美国Abcam公司。免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，RNA提取试剂盒(QIAGEN公司，批号74104)，反转录试剂盒、荧光染料(Roche公司)，PCR引物由金唯智生物科技有限公司设计合成。

1.3.3 仪器 全自动酶标分析仪(Bio-Rad公司，型号iMark)，荧光PCR仪(Bio-Rad公司，型号CFX96)，凝胶扫描成像系统(Bio-Rad公司)，电子天平(上海精密科学仪器有限公司，型号FA2004N)，医用低速离心机(金坛市恒丰仪器厂，型号LX-820)等。

1.4 取血 末次给药24 h后，并禁食10 h(过夜)，次日测量所有大鼠的体质量，随后腹腔注射10%水合氯醛(1.5 ml/100 g)麻醉大鼠，腹主动脉采血5 ml，注入试管内，4 ℃下3 500 r/min离心15 min(离心半径7 cm)，分离血清，-20 ℃保存，待用。

1.5 血清PYY水平的检测 ELISA法检测血清PYY水平，严格按照ELISA测定试剂盒说明书步骤进行操作。批内变异系数为8.5%，批间变异系数为13.5%。

1.6 免疫组化法测定结肠组织PYY表达 取部分结肠组织，适当修整后放入4%多聚甲醛中固定。(1)石蜡切片：40 ℃过夜,60 ℃烤片1 h；(2)石蜡切片脱蜡至水；(3)抗原修复：枸橼酸缓冲液(pH值6.0，北京中杉金桥生物技术有限公司)逐渐加热至95～98 ℃恒温保持，放入玻片，恒温维持60 min；室温放置自然冷却，PBS冲洗5 min×3次；(4)滴加内源性过氧化物酶封闭液(北京中杉金桥生物技术有限公司)50 μl，避光室温孵育10 min；PBS冲洗5 min×3次；(5)封闭：滴加正常山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)30 μl，37 ℃孵育15 min，甩干不洗；(6)滴加稀释5-羟色胺(5-HT)抗体(美国abcam公司)30 μl，然后4 ℃过夜。用PBS替代一抗作为阴性对照，在冰箱4 ℃孵育12～16 h；次日取出，室温放置10 min，PBS冲洗5 min×3次；(7)滴加二抗工作液(美国Abcam公司)50 μl，37 ℃孵育30 min ；PBS冲洗5 min×3次；(8)滴加HRP标记的链霉亲和素(北京中杉金桥生物技术有限公司)50 μl，37 ℃孵育15 min；PBS冲洗5 min×3次；(9)DAB显色：DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K132429A)按试剂说明书配置，光镜下观察，至目的组织出现阳性颗粒而周围组织无非特异显色时，蒸馏水冲洗10 min；(10)苏木素复染细胞核1～2 min，1%盐酸乙醇分化数秒，镜下控制(在×400物镜下，每张切片检测10个视野，用平均积分光密度代表PYY相对水平)，自来水冲洗返蓝10 min；脱水、透明、封固。

1.7 RT-RCR法测定结肠组织PYY mRNA水平 (1)总RNA的提取：取30 mg结肠组织提取总RNA，液氮速冻后碾磨组织，加入600 μl RLT裂解液裂解组织，将所得溶液于4 ℃下12 000 r/min离心3 min(离心半径7 cm)；加入70%乙醇600 μl后，立即转移700 μl溶液(包括沉淀)至柱子上，离心15 s(12 000 r/min，离心半径7 cm)，完全滤过溶液；分别加入700 μl Buffer RW1、500 μl Buffer RPE，于4 ℃下离心15 s(12 000 r/min，离心半径7 cm)，弃滤液，加入500 μl Buffer RPE离心2 min(12 000 r/min，离心半径7 cm)，弃滤液；将柱子移入至新的2 ml试管中，离心1 min(12 000 r/min，离心半径7 cm)，干燥滤膜，将柱子移入新的1.5 ml试管中加入30～50 μl无酶水，离心1 min(12 000 r/min，离心半径7 cm)得到RNA；同时取2 μl RNA样品稀释50倍后测定样品在260 nm和280 nm的吸光度(OD)值，OD260/OD280在1.8～2.0之间视为提取的总RNA质量纯度较好。(2)反转录获得第一链cDNA：使用反转录试剂盒(Roche公司，0489686-6001)，严格按照说明书进行反转录总mRNA，合成第一链cDNA，反应产物在-20 ℃冰箱中保存备用。引物设计与合成：β-actin正向引物为5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反向引物为5′-CGCTCATTGCCGATAGTG-3′；PYY正向引物为5′-CTGCGCCACTACCTCAAVVT-3′，反引向引物为5′-TCTCGCTGTCGTCTGTGAAGA-3′。(3)cDNA的PCR扩增：使用FastStart Universal SYBR Green MASTER(ROX)，实验步骤参照说明书，采用总体积50 μl反应体系，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，45个循环。实验重复3次。所得数据使用PCR仪自带软件算出CT值并用2-ΔΔCT法做相对定量分析。

2 结果

2.1 血清PYY水平 各组血清PYY水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组血清PYY水平高于WKY组，差异有统计学意义(P<0.05)；镇肝熄风汤高剂量组血清PYY水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 结肠组织PYY水平 各组结肠组织PYY水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组结肠组织PYY水平高于WKY组，差异有统计学意义(P<0.05)；贝那普利组和镇肝熄风汤高、中、低剂量组结肠组织PYY水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；镇肝熄风汤高剂量组结肠组织PYY水平低于贝那普利组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。免疫组化结果显示，WKY组黏膜下腺体上皮细胞胞质中PYY不表达；模型组靠近黏膜下层的腺上皮细胞胞质中PYY高表达，尤其在靠近黏膜下层腺体中表达尤为明显；贝那普利组黏膜下腺体上皮细胞胞质中PYY中度表达；镇肝熄风汤低剂量组黏膜下腺体上皮细胞胞质中PYY中度表达；镇肝熄风汤中剂量组黏膜下腺体上皮细胞胞质中PYY弱表达；镇肝熄风汤高剂量组黏膜下腺体上皮细胞胞质中PYY弱表达(见图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

表1 各组大鼠血清PYY水平比较

注：与WKY组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；PYY=酪酪肽

表2 各组大鼠结肠组织PYY水平比较

注：与WKY组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与贝那普利组比较，cP<0.05

2.3 结肠组织PYY mRN水平 各组结肠组织PYY mRNA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组结肠组织PYY mRNA水平高于WKY组，差异有统计学意义(P<0.05)；贝那普利组和镇肝熄风汤高、中剂量组结肠组织PYY mRNA水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；镇肝熄风汤高剂量组结肠组织PYY mRNA水平低于贝那普利组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

注：A为WKY组，B为模型组，C为贝那普利组，D为镇肝熄风汤高剂量组，E为镇肝熄风汤中剂量组，F为镇肝熄风汤低剂量组

图1 各组大鼠结肠组织PYY表达(免疫组化染色，×400)

注：与WKY组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与贝那普利组比较，cP<0.05

3 讨论

高血压的发生与多重因素相互影响有关，目前普遍认为高血压是遗传易感性和环境因素共同作用的结果，而在这一过程中胃肠激素可能起主要作用。胃肠激素调节异常可能是高血压发病的重要因素，其可能通过信号传导至下丘脑弓状核，进而参与食物摄入和能量消耗的调节[5-6]。研究发现，胃肠激素是消化系统和心血管系统的重要调节因子，可能影响高血压的发生发展[7]。PYY是一种重要的胃肠激素，属于胰多肽家族成员，分布于中枢神经系统及外周神经系统。PYY作为一种调节肽，通过位于靶细胞的PYY受体向组织细胞内传递信息[8]。MANNON[9]研究认为，PYY在体内与Y1受体结合后可能通过细胞膜蛋白激酶和细胞外信号调节蛋白激酶促进肠上皮细胞增殖。PYY与营养、摄食、能量平衡有着重要的关系[10]，是一个调节摄食的饱感信号[11]。研究发现，胃肠激素除了经典的内分泌途径外，还有通过血液循环或局部组织液扩散的旁分泌途径[12]，而PYY 3-36是PYY在血液循环中的主要存在形式[13]。而有关PYY与高血压的关系，国内外相关基础研究的文献报道较少，本实验从分子生物学角度初步阐明SHR PYY的变化。

镇肝熄风汤出自《医学衷中参西录》，专为“类中风”而设，用以镇肝熄风，滋阴潜阳。张锡纯重视脾胃气机升降，注重引血下行，强调“宜急治以降胃、镇冲、平肝之剂，再以滋补真阴药辅之，庶可转上升之气血下行”。研究认为，镇肝熄风汤可激活脑组织过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPARγ)mRNA的表达，减少脑组织中血管内皮素(ET)的分泌，使脑血管扩张，从而对SHR产生脑保护作用[14]。本实验通过ELISA法检测血清PYY水平，结果显示，模型组大鼠血清PYY水平较WKY组升高；而镇肝熄风汤高剂量组血清PYY水平较模型组降低。由此推测，SHR血清PYY水平升高可能与血压升高相关。本实验进一步以PYY在SHR结肠组织中的表达作为切入点，从分子生物学角度探索高血压与PYY的关系，通过免疫组化法及RT-PCR法分别对各组大鼠结肠组织PYY及其mRNA水平进行检测，结果显示，模型组结肠组织PYY及其mRNA水平高于WKY组；贝那普利组和镇肝熄风汤高、中剂量组结肠组织PYY及其mRNA水平低于模型组，而镇肝熄风汤高剂量组结肠组织PYY及其mRNA水平低于贝那普利组，表明镇肝熄风汤可使SHR结肠组织PYY mRNA水平降低。免疫组化检测结果显示，贝那普利和镇肝熄风汤能抑制L细胞的分泌功能，而镇肝熄风汤高剂量组的抑制作用更强，使PYY在黏膜层底部细胞表达减弱，进而降低结肠组织PYY水平。

综上所述，SHR血清和结肠组织中存在PYY表达异常，镇肝熄风汤可以调节改善PYY水平，这可能是其降压机制之一。

本研究创新点/不足：

(1)本研究以高血压发病机制中，遗传与环境因素可能通过胃肠激素途径影响血压调控为假说，探索高相关胃肠激素类脑肠肽与高血压的相关性，可能是对高血压发病机制中的神经、体液调节的一项重要补充，通过镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠(SHR)胃肠激素调节的研究，初步阐明张锡纯名方镇肝熄风汤体现脾胃学说的实验基础及影响血压调控的可能机制。

(2)本研究仅通过酪酪肽(PYY)这一指标进行相关研究，目前只能揭示高血压与胃肠激素的某一相关性，尚不能完全阐明胃肠激素调节异常是否与高血压发病机制相关，胃肠激素类脑肠肽与高血压的发病机制仍需深入研究。

作者贡献：金华负责实验设计、组织实施，撰写论文并对文章负责；刘志军、张秋菊、颜春鲁、刘峰林、窦荣海、温鑫洋、曹强、苏莉莉负责动物实验、指标检测和资料整理；陈丽、胡继宏负责数据统计；徐厚谦负责质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔莎)

Influence of Zhengan Xifeng Decoction on the Expression of Peptide Tyrosine Tyrosine in Spontaneously Hypertensive Rats

JINHua1,2*,LIUZhi-jun1,ZHANGQiu-ju1,YANChun-lu1,LIUFeng-lin1,CHENLi1,XUHou-qian1,HUJi-hong1,DOURong-hai1,WENXin-yang1,CAOQiang1,SULi-li1

1.GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China2.GansuProvinceKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicinePrescriptionExcavationandInnovationandTransformation,Lanzhou730000,China

Objective To investigate the influence of Zhengan Xifeng decoction on the expression of peptide tyrosine tyrosine(PYY) in spontaneously hypertensive rats(SHRs).Methods We randomly assigned 75 SHRs(14 weeks old,male) into model group(n=15),Benazepril group(n=15),Zhengan Xifeng decoction high,medium,and low dose groups(15 SHRs in each group),and set 15 WKY rats as the WKY group between June 2012 and April 2015.During the intervention period of 8 weeks,six rats died in model group,WKY group,Zhengan Xifeng decoction high, medium, and low dose group,seven rats died in Benazepril group.The rats in model group and WKY group were given the same volume of distilled water every day,Benazepril group were fed with Benazepril 0.90 mg·kg-1·d-1,Zhengan Xifeng decoction high,medium,and low dose groups were fed with Zhengan Xifeng decoction 15,30,60 g·kg-1·d-1,respectively.At the end of intervention,the level of PYY in serum was detected by ELISA,the expression of PYY and its mRNA in colon was detected by immunohistochemistry and RT-PCR.Results The serum PYY levels in model group were significant higher than those in WKY group(P<0.05).Zhengan Xifeng decoction high dose group had lower serum PYY levels than model group(P<0.05).Compared with the model group,the expression of PYY in colon was lower in the WKY group(P<0.05) as well as in Benazepril group,and Zhengan Xifeng decoction high,medium,and low dose groups(P<0.05).The expression of PYY in colon in Zhengan Xifeng decoction high dose group was lower than that in Benazepril group(P<0.05).WKY group had lower expression of PYY mRNA in colon than model group(P<0.05),likewise,Benazepril group,and Zhengan Xifeng decoction high,medium dose groups possessed lower expression of PYY mRNA in colon than model group(P<0.05).Zhengan Xifeng decoction high dose group displayed a lower expression of PYY mRNA in colon in comparison to Benazepril group(P<0.05).Conclusion SHRs have regulation disorder of PYY in colon.The antihypertensive effect of Zhengan Xifeng decoction may be realized by regulating the expression of PYY.

Rats,inbred SHR;Zhengan Xifeng decoction;Peptide tyrosine tyrosine

国家自然科学基金资助项目(81160477)；甘肃省自然科学研究基金计划(1107RJZA220)；甘肃省高等学校基本科研业务费资助项目(2010-5)

R -332

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.09.014

2016-09-19；

2017-02-10)

1.730000甘肃省兰州市，甘肃中医药大学

2.730000甘肃省兰州市，甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室

*通信作者：金华，教授；E-mail:lanzhoujinhua@126.com

*Correspondingauthor:JINHua,Professor;E-mail:lanzhoujinhua@126.com