生鲜乳中大肠杆菌的分离及其ERIC-PCR指纹分析

钟召兵，侯磊，王宁，杨夫会

(1.泰安市岱岳区畜牧兽医局，泰安 271000；2.泰安市畜牧兽医局，泰安 271000)

生鲜乳中大肠杆菌的分离及其ERIC-PCR指纹分析

钟召兵1，侯磊2，王宁1，杨夫会1

(1.泰安市岱岳区畜牧兽医局，泰安 271000；2.泰安市畜牧兽医局，泰安 271000)

通过了解生鲜乳收购站的生鲜乳大肠杆菌污染情况及不同菌株间的遗传相似性，为日常生产中实时控制生鲜乳大肠杆菌提供了有效技术手段。采用国家规定的标准方法检验从生鲜乳分离的大肠杆菌，分析分离细菌的ERIC-PCR DNA指纹图谱。共采集115份样品，从23份中分离到大肠杆菌25株。ERIC-PCR DNA指纹图谱分析，25株分离菌遗传相似性在56%～100%之间。结果显示，生鲜乳中存在大肠杆菌污染，同一个生鲜乳收购站大肠杆菌的基因型可有不同，不同生鲜乳收购站之间也存在相同基因型大肠杆菌污染。

生鲜乳；大肠杆菌；分离鉴定；ERIC-PCR

乳品营养丰富，是优质的营养食品，同时也是微生物的良好培养基，在生产加工运输过程中极易被微生物污染[1]，污染后会导致乳品变质，严重者会引起食物中毒等后果。大肠杆菌是乳品国家标准中规定的菌群检测项目的主要目标物，且是食品级饮用水受粪源污染的重要微生物学指标[2]。有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标[3]，因此从生鲜乳中分离大肠杆菌不仅可以为评估微生物污染提供有价值的信息，其基因分型还可以用于乳及乳制品生产过程中污染源的追踪[4]。

近年来随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应（PCR）技术的发展，出现了一系列的分子生物学分型方法[5]，其中细菌基因间重复共有序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）分型技术是以肠杆菌科基因重复序列为引物进行PCR，能扩增出多态性的DNA图谱[6]。DNA条带特征能反映出细菌整个基因组结构的差异，能区别含有ERIC这些重复序列的不同菌种或株，因此具有很强的鉴别菌种乃至菌株的能力[7]。ERIC-PCR作为一种行之有效的分子分型技术，已经被用作一种分子流行性病学调查方法[8]。

本研究从28个生鲜乳收购站的生鲜乳中分离大肠杆菌，通过菌株的ERIC-PCR指纹图谱分析分离株的同源性，为在生鲜乳及乳制品生产中控制大肠杆菌污染及追踪污染源提供一种有效的技术方法。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

严格按样品采集规范要求，从生鲜乳收购站奶厅制冷罐中采集生鲜乳样共计115份，冷藏保存待检。

1.2 主要试剂及仪器缓冲蛋白胨水、S C肉汤、伊红美蓝琼脂、麦康凯3号琼脂（Oxoid）。Taq DNA聚合酶、P C R反应试剂（大连宝生物公司产品），EppendorfPCR扩增仪（AG22331），上海天能科技有限公司凝胶成像系统（tanon-2500）。引物1(3′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5′)和引物2(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)由大连宝生物公司合成。

1.3 大肠杆菌的培养

无菌条件下各取100mL样品，分别加入装有225mL缓冲蛋白胨水增菌液的广口瓶内，混合均匀，于36±1℃恒温箱培养18～24h；移取0.1mL转种于盛有10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC肉汤）的试管内，摇匀，于36±1℃培养6～8h。

1.4 大肠杆菌的分离鉴定

取待检菌料，分别接种于伊红美蓝琼脂培养基平板上37℃培养18～24h；挑取黑色金属闪光的菌落，再次接种麦康凯3号琼脂培养基平板，37℃恒温培养过夜。所有的阳性菌落经过“KOH反应”试验鉴定是否为革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌用API 20 E鉴定。

1.5 模板的制备

将大肠杆菌接种到5mL Luria-Bertani培养基中振荡培养18h。然后取出培养液置1.5mL Eppendorf 管中，10 000r/min离心2min，弃上清，用100μL TE缓冲液悬浮沉淀，在100℃条件下煮沸10min，再迅速冰浴5min，最后12 000r/min离心2min，取上清液作为模板，在-20℃条件下保存备用。

1.6 ERIC-PCR反应

ERIC-PCR反应体系25μL：1×缓冲液，0.875mmol/ μ LdNTP，1.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，引物各300ng/μL，2μL模板DNA，最后用灭菌双蒸水补充至25μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，51℃复性1min，72℃延伸3min，共32个循环，最后72℃延伸16min结束反应。

PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，以DL2000Maker（TaKaRa）作为分子量参照，凝胶成像后，用透射紫外灯观查结果。为了减少误差，所有分离菌的ERIC-PCR均在同一反应条件下一次完成，反应产物加样于同一块凝胶中进行电泳。

1.7 ERIC-PCR指纹分析

记录扩增产物的电泳谱带。样品有扩增带，赋值为“1”，无扩增带，赋值为“0”，用电泳图象分析软件（Gel Image System）进行分析。采用非加权对数算术平均法（UPGMA）、利用NTSYS-pc 2.10软件构建聚类树状图进行聚类分析。每一个分离株看作是一个分类学单位（Operational Taxonomic Unit,OTU），并且把≥90%相似性的菌株看作是一个分离株[9]。

2 结果

2.1 大肠杆菌分离鉴定

115份样品中，有23份分离到大肠杆菌，阳性率平均为21.74%。牛乳中有21份分离到大肠杆菌，阳性率为20.59%（21/102）；羊乳中有2份分离到大肠杆菌，阳性率为15.38%（2/13）。本次试验共分离到菌株25株，其中牛乳22株、羊乳3株（见表1）。

表1 生鲜乳中大肠杆菌的分离情况

2.2 ERIC-PCR鉴定

图1 25株大肠杆菌菌的ERIC-PCR聚类图

用ERIC-PCR方法对从生鲜乳中分离的大肠杆菌进行扩增，根据电泳谱带绘制的UPGMA遗传进化树见图1。25株分离大肠杆菌遗传相似性分别在56%～100%之间。有12株（菌株1与菌株2；菌株24与菌株25；菌株7与菌株13及菌株10；菌株11与菌株12；菌株18与菌株19及菌株20）两两之间的同源性＞90%，其中株菌17与菌株21的相似性为100%。

3 讨论

乳及乳制品质量安全生产是通过对整个供应链（即从农场到餐桌的过程）的控制达到的，过去对最终产品质量合格检验的控制模式，已经不能适应现代的乳及乳制品质量安全生产的发展需要。在整个供应链当中，奶源是供应链的起点，乳制品是最终产品，这两点是乳品质量安全得以实现的关键[10]。

众多的乳制品质量安全问题严重阻碍了我国乳制品行业的发展。造成质量安全问题的原因是多方面的，其中生鲜乳及乳制品微生物超标是重要原因之一。在生鲜乳及乳制品生产中，大肠杆菌超标是一个重要的卫生安全问题[11]。本研究按照食品卫生微生物学检验-大肠杆菌检验标准对采集的生鲜乳进行大肠杆菌分离鉴定，并分析分离株的同源性[12]。结果从115份样品中的23份中分离到25株大肠杆菌，其中牛乳阳性率为20.59%（21/102），羊乳阳性率为15.38%（2/13），高于袁丹茅[13]、赵承辉[14]报道的分离率。

细菌的传统分类方法难以区分同一种类中极为相近的菌株。研究发现，肠道菌中的ERIC序列是一段长126bp的反向重复序列，定位于基因组内可转录的非编码区域与转录有关的区域[15]。ERIC序列分布于整个基因组中，具有极强的保守型，用ERIC-PCR得到的DNA条带特征能反映出细菌整个基因组结构的差异，能区别包含有ERIC这些重复序列的不同细菌种和菌株，因此具有很强的鉴别菌种乃至菌株的能力[16]。Borges等人[17]用重复序列为特异引物，以污染水中分离的大肠杆菌的染色体DNA为模板进行PCR扩增，发现分离菌株产物在琼脂糖凝胶电泳分离时能各自显示出独特的条带特征，确认出相似指数和遗传距离，从而有效区分不同的菌株。Ibenyassine等人[18]用ERIC-PCR对受污水灌溉的蔬菜中的大肠杆菌进行指纹图谱分析与限制性片段长度多态性（RFLPs）分析得到一致结果。Hulton等人[19]用ERIC-PCR指纹图谱分析方法对大肠杆菌、沙门氏菌和其他肠杆菌及其结构进行了初步鉴定，同时也区分了不同的血清型。

本研究通过ERIC-PCR方法得到25株大肠杆菌的指纹图谱，大肠杆菌遗传相似性分别在56%～100%之间，有12株两两之间的同源性＞90%。不同奶站大肠杆菌之间的同源性＞90%，说明不同奶站之间存在被同一株大肠杆菌污染的情况。菌株15与其他菌株之间的同源性仅为56%，说明污染奶站的大肠杆菌存在多样性的特点。

普遍认为大肠杆菌是生鲜乳及乳制品的污染源，因此大肠杆菌是生鲜乳及乳制品生产中最重要的目标控制微生物之一，其数量的高低直接反映生产过程的卫生状况，对大肠杆菌的检测及同源性分析意义重大。作为一种分子分型技术，ERIC-PCR可用于生鲜乳大肠杆菌的基因分型研究。

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Identifcation and Analysis on the DNA Fingerprints of E.coli in Fresh Milk Using ERIC-PCR

ZHONG Zhao-bing1, HOU Lei2, WANG Ning1, YANG Fu-hui1
(1.Taian Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Taian 271000; 2.Taian District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Taian 271000)

To determine the prevalence of E.coli infection in fresh milk and genetic similarities between different strains, and then provide an effective technological support for the real-time monitoring E.coli in the dairy production in raw and fresh milk acquisition station. A conventional culture-based study was performed and E.coli strains were isolated and identifed. E.coli strains were amplifed using ERIC-PCR and then their DNA fngerprints were analyzed. E.coli was detected in 23/115 samples and 25 E.coli strains were obtained, the twenty-fve E.coli strains genetic similarity index was 50%～100%. The results showed that fresh milk was contaminated with different strains of E.coli. Different genotypes of E.coli were present in the same raw and fresh milk acquisition station sample and same genotypes was present in different raw and fresh milk acquisition station sample.

Fresh milk; E.coli; Isolation and identifcation; ERIC-PCR

TS252.1

A

1004-4264（2017）03-0036-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.011

第二届“牛人”摄影大赛作品 《圣牧花园牧场》——崔淑芳 圣牧高科

2016-12-13

泰安市科技计划项目（奶牛高产高效繁育技术集成示范[2016]）。

钟召兵（1980-），男，山东诸城人，硕士，研究方向为畜禽环境空气病原微生物的分离与鉴定。