生鲜乳中黄曲霉毒素M1检测方法的探索

刘宝华，高杨

（黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司，哈尔滨 150001）

生鲜乳中黄曲霉毒素M1检测方法的探索

刘宝华，高杨

（黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司，哈尔滨 150001）

在GB 5413.37-2010第二法的基础上，建立一种免疫亲和柱净化－高效液相色谱紫外法检测生鲜乳中AFM1的含量，更加符合多数乳品企业只具备紫外检测器的应用实际。其检出时间为6.825min，比GB 5413.37-2010第二法缩短了1.175～2.175min，平均回收率为90.6%～98.3%，相对标准偏差为2.97%～5.12%，检出限为0.1μg/kg，均满足分析要求。结果表明本方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度，是一种值得推广的检测方法。

生鲜乳；黄曲霉毒素M1（AFM1）；检测方法

黄曲霉毒素M1（AFM1）是黄曲霉毒素B1（AFB1）的羟基化代谢产物，能导致肝脏发生病变，甚至癌变，于1933年被世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构列为一级致癌化合物[1]，是一种毒性极强的剧毒物质。生鲜牛乳中AFM1的存在，主要是由于奶牛食用了受黄曲霉毒素污染的饲料，经乳畜体内羟化酶转化而生成。世界许多国家（组织）均设定了生鲜乳中AFM1的允许残留标准，欧盟为0.05μg/kg，中国和美国为0.50μ g/kg[2,3]。而我国针对生鲜乳中AFM1的控制与检测方法还在不断探讨中，因此开展生鲜乳中AFM1的监测工作具有重要意义。

目前，生鲜乳中AFM1的检测方法主要有薄层色谱分析法（TLC）[4～6]、高效液相色谱法（HPLC）[7～9]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[9]、免疫亲和柱-荧光分光光度法[7,10]、酶联免疫吸附测定法（ELISA）[11,12]、双流向酶联免疫吸附法（SNAP）[13]、单克隆抗体试剂盒法[14]。本研究在食品安全国家标准《乳和乳制品中AFM1的测定》（GB 5413.37-2010）第二法的基础上[15]，以紫外检测器代替荧光检测器与高效液相色谱串联，建立了免疫亲和柱净化－高效液相色谱紫外检测法来检测原料乳中的AFM1，希望能为进一步控制生鲜乳的质量安全提供一种更理想的检测方法。

1 试验材料与设备

1.1 试验材料

生鲜牛乳（青山牧场）、甲醇（分析纯）（科密欧化学试剂有限公司）、甲醇（色谱纯）（赛默飞世尔科技有限公司）、AFM1标准品（迪马科技公司）、超纯水 （实验室自制）。

1.2 试验仪器与设备

Waters1525高效液相色谱仪（美国Waters公司）、Waters2487紫外检测器（美国Waters公司）、Cloversil-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）（迪马科技公司）、免疫亲和柱：AFLATEST-P柱（美国VICAM公司）、超速离心机（上海卢湘仪离心机有限公司）、DCY-125型氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）、Simplicity185 型纯水机（美国密理博公司）。

2 试验方法

2.1 样品的处理

2.1.1 样本前处理

将生鲜乳样品在4 000r/min下离心15min，收集30mL下层试样。

2.1.2 样本的净化

用移液管移取25mL试样到50mL注射器中，调节真空系统，控制试样以2～3mL/min的稳定流速过柱。取下50mL的注射器，装上10mL注射器。注射器内加入10mL水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。

2.1.3 洗脱

脱开真空系统，装上另一个10mL注射器，加入5mL甲醇。缓缓推动注射器栓塞，通过柱塞控制流速，洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在棕色锥形管中，然后用和缓的氮气在30℃下将洗脱液蒸发至近干，再用水定容至最终体积为500μL。用0.22μm的微孔滤膜过滤后，上机测定。

2.2 AFM1标准曲线的绘制

根据高效液相色谱仪进样环的容积，分别注入含有0.025ng、0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng的黄曲霉毒素M1标准溶液，按浓度由低到高的顺序进样。以黄曲霉毒素M1的质量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3 样品中的AFM1分析

根据样品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素M1的保留时间进行定性分析；根据黄曲霉毒素M1的峰面积值，从标准曲线上得出样品洗脱液中所含有的黄曲霉毒素M1质量数（ng）。

如果样品洗脱液的黄曲霉毒素M1的峰面积值高于标准曲线范围，用水定容稀释样品洗脱液后，重新进样分析。

2.4 加标回收率试验

在生鲜牛乳样品中分别添加质量浓度为0.1μ g/kg、0.5μ g/kg、1.0μg/kg三个梯度的黄曲霉毒素M1，进行加标回收率试验，每个梯度做6组平行试验，计算回收率和相对标准偏差，确定方法的准确度和精密度，并通过添加试验确定方法的检出限进而确定其灵敏度。

2.5 色谱条件

参考GB 5413.37-2010和有关文献[8,15]选取色谱条件。色谱柱：Cloversil-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇水溶液；流速：1mL/min；检测波长：365nm；柱温：25℃；进样体积：50μL。

3 结果与分析

3.1 流动相的选择

通过试验确定流动相最佳配比为甲醇∶水=50∶50，在上述色谱条件下，对5个浓度梯度的黄曲霉毒素M1标准液（0.025ng、0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng）进行分离检测，得标准溶液色谱图（如图1所示）。从图中可以看出黄曲霉毒素M1的保留时间平均为6.825 min，且色谱峰峰形尖锐，对称性好，无杂质干扰。国标方法中以乙腈作为流动相，而本研究采用甲醇作为流动相，在同等试验条件下，溶剂中甲醇的浓度对色谱峰的峰形影响较小，并且避免了毒性较大溶剂乙腈的使用。

图1 不同质量浓度的AFM1标准色谱图

3.2 方法的线性范围与回归方程

5个浓度的黄曲霉毒素M1标准品的质量与对应峰面积的标准曲线见图2。

图2 AFM1的标准曲线

由标准曲线可以看出，AFM1标准曲线的线性回归方程为Y=42.342X+0.8729，相关系数R2= 0.9997，说明AFM1质量浓度在0.025～0.4ng范围内线性关系良好。

3.3 方法的准确度、精密度及灵敏度

通过加标回收率试验计算生鲜乳中添加的AFM1的回收率及相对标准偏差，依此检验方法的准确度和精密度，并根据加标回收率试验确定方法的检出限，进而确定其灵敏度，结果见表1。

表1 加标生鲜乳样品中AFM1回收率和相对标准偏差

由表1可以看出，本方法在0.1～1.0μg/kg范围内，平均回收率为90.6%～98.3%，相对标准偏差为2.97%～5.12%，满足了定量检测和GB 5413.37-2010中对回收率大于80%的要求[15,16]及相对标准偏差小于10%的要求[17]，与陈瑞春[8]等建立的免疫亲和柱高效液相色谱荧光检测法测定生鲜乳中AFM1的含量回收率在58.6%～86.7%之间、相对偏差3.37%～16.9%之间和牛军小[9]等建立的免疫亲和柱-反相高效液相色谱法测乳和乳制品中的AFM1含量平均回收率在80.1%～88.9%之间、相对偏差为3.3%～4.6%相比，本文回收率平均提高10%、相对偏差平均减小1%，说明本方法具有较高的准确度及精密度。

加标生鲜乳样品中黄曲霉毒素M1的色谱图见图3，从图中可以看出，免疫亲和柱净化效果较好，基本没有干扰峰和杂质峰。根据加标试验确定的本方法检出限为0.1μg/kg，满足我国国家标准对乳及乳制品黄曲霉毒素M1限量为0.5μg/kg的检测要求[18]，并与张鹏[19]等建立的牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M1快速测定法的黄曲霉毒素M1检测低限为0.1μg/kg相同，说明本方法具有较高的灵敏度。

图3 加标生鲜乳样品中AFM1的色谱图

3.4 检测速度的对比

此检测方法与国标GB 5413.37-2010中第二法（免疫亲和柱净化高效液相色谱荧光检测法）[15]相比，检测时间由8～9min缩短至6.825min，缩短了1.175～2.175min；与陈瑞春[8]等建立的免疫亲和柱高效液相色谱荧光检测法相比，检出时间缩短了1.192 min，即大约缩短时间为14.9%，说明本法检测速度较快。

4 结论与讨论

与薄层色谱分析法（TLC）的预处理和测定步骤均较复杂、耗时、灵敏度差和高效液相色谱法（HPLC）样品处理繁琐、操作复杂，不能满足某些企业只能用紫外检测器进行检测的需求，以及酶联免疫吸附法（ELISA）重复性差、试剂寿命短及准确性差相比，本研究建立的用免疫亲和柱净化-高效液相色谱紫外法检测AFM1含量的方法，在检测仪器上虽然紫外检测器较荧光检测器灵敏度低，但是更符合大多数乳品企业未配备荧光检测器的实际，而且免疫亲和柱净化有着较好的权威性和通用性，为国外多个组织所认可，被列为标准方法，可应用于不同的基质。且本法检出时间为6.825min，比国标GB 5413.37-2010中第二法缩短了1.175～2.175min，平均回收率为90.6%～98.3%，相对标准偏差为2.97%～5.12%，检出限为0.1μg/kg，均满足分析要求，说明本方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度，并且此方法简单易行、操作性较强，是一种值得推广的检测方法。

国际和国内对牛奶中黄曲霉毒素M1的限制正在逐步加强，限量标准也在不断降低，所以更需要找到一种灵敏度高、特异性强、简便快速容易普及应用的方法来检测黄曲霉毒素M1，本方法适应了这种需求。

[1] 熊江林,王艳明,刘建新. 牛奶中黄曲霉毒素M1的来源和控制途径[J]. 中国畜牧杂志,2012,23:82-87.

[2] Annandale, D. Mining company approaches to environmental approvals regulation: a survey of senior environment managers in Canadian [J]. Resources Policy, 2000, 26:51-59.

[3] Cox L A, Popken D A .Quantifying potential human health impacts of animal antibiotic use: enrofloxacin and macrolides in chickens[J]. Risk Anal, 2006, 26(1):135-146.

[4] 郑楠,王加启,韩荣伟,等. 牛奶中霉菌毒素检测方法的研究进展[J]. 中国畜牧兽医,2012,03:14-18.

[5] Paradkar, M.M, Slnghal, R.S.and Kulkarni, P. R. An approach to the detection of synthenic milk in dairymilk[J]. Detection of urea.International journal of Dairy Technology, 2000,53(3):87-91.

[6] Lamba S, Sangh ISK, A sthana A, et al. Rapid Determ ination of Sulfonam ides in Milk Using M icellar Electrok ineticCh roma to graphy with Fluo rescence Detection[J]. A nal. Chim. Acta, 2005,552(3):110-115.

[7] 赵飞,焦彦朝,连宾,等. 黄曲霉毒素检测方法的研究进展[J]. 贵州农业科学,2006,05:123-126.

[8] 陈瑞春,段文仲,吕红英,等. 免疫亲和层析净化-高效液相色谱法同时测定牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2[J]. 食品科技,2011,08:300-304.

[9] 牛军小,苏军,徐晓枫,等. 免疫亲和柱净化-反相高效液相色谱法检测乳与乳制品中黄曲霉毒素M1[J].中国卫生检验杂志,2014,07:940-941+945.

[10] 王蕾. 牛奶中黄曲霉毒素M1检测方法的建立及饲料中黄曲霉毒素对牛奶品质的影响[D]. 郑州:河南农业大学,2008.

[11] 赵红霞. 超高效液相色谱—三重四极杆串联质谱（UPLCQQ-MS/MS）对农作物中农药多残留的检测研究[D]. 济南:山东大学,2013.

[12] 陈曦. 一种新型结直肠癌单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定[D]. 重庆:第三军医大学,2007.

[13] 黄良策. 牛奶中多霉菌毒素UPLC-MS/MS检测方法建立及其风险分析研究[D]. 合肥:安徽农业大学,2013.

[14] 刘然. 黄曲霉毒素M1检测试剂盒的制备及其原料乳含量预警机制[D]. 天津:天津商学院,2006.

[15] GB 5413.37-2010, 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[16] 单安山,周长路,张圆圆,等. 东北地区不同饲料原料中霉菌毒素含量的测定[J]. 东北农业大学学报,2013,06:96-100.

[17] JohnA.Rice (作者), 田金方 (译者). 数理统计与数据分析[M].北京:机械工业出版社, 2011:149-152.

[18] GB 2761-2011. 食品中真菌毒素限量[S]. 北京:中国标准出版社, 2011:

[19] 张鹏,张艺兵,王晶,等.牛奶及奶粉中黄曲霉毒素M1的快速测定[J]. 中国乳品工业,2002,30(6):30-32.

Research on a Detection Method of Afatoxin M1in Fresh Milk

LIU Bao-hua, GAO Yang
(Heilongjiang Province Longdan Dairy Industry Science and Technology Co., LTD, Harbin 150001)

On the basis of second method of GB 5413.37-2010, a detection method of AFM1in fresh milkimmunoaffnity column purifcation and HPLC-UV detection method was established, which was more in line with the fact that majority of dairy enterprises only had the application of UV detector. The detection time was 6.825min which was 1.175～2.175min shorter than the second method of GB 5413.37-2010, and the average recovery rate was 90.6%～98.3%, and the relative standard deviation was 2.97%～5.12%, and the detection limit was 0.1g/kg, and all of these met the analytical requirements. The results show that the method is of high accuracy, precision and sensitivity, and so it is worth promoting.

Fresh milk; Afatoxin M1(AFM1); Detection method

TS252.1

A

1004-4264（2017）03-0040-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.012

2016-08-01