德国进境海棠树根际中厚皮拟毛刺线虫的鉴定

宋绍祎，刘静远，徐沈裕，戚龙君，于 翠，易建平

（上海出入境检验检疫局，上海 200135）

德国进境海棠树根际中厚皮拟毛刺线虫的鉴定

宋绍祎，刘静远，徐沈裕，戚龙君，于 翠，易建平*

（上海出入境检验检疫局，上海 200135）

从上海口岸进境的德国海棠景观树根际分离到1种拟毛刺属线虫。雌虫双生殖腺对伸，受精囊无，精子分布于子宫内；阴门孔状，阴门骨化结构小，圆三角形到椭圆形，微分离。雄虫腹中颈乳突1个，位于排泄孔前；精子大，胞核香肠形；交合刺末端微腹弯，杆区有横纹；交合伞狭窄；泄殖腔前有3个腹中交配乳突。厚皮拟毛刺线虫特异引物UNIVERSAL-F/PACHYREV2-R检测为PCR阳性，其18S序列与GenBank中厚皮拟毛刺线虫的序列相似性为99.30%—100%，序列差异为0—4 bp。基于18S序列构建的系统发育树显示该种线虫与厚皮拟毛刺线虫位于同一聚类组内。经形态分类鉴定、PCR检测和序列分析，将此线虫鉴定为厚皮拟毛刺线虫Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus。这是我国口岸首次截获该种线虫。

厚皮拟毛刺线虫；传毒种；系统发育；鉴定

毛刺属和拟毛刺属线虫是一类重要的植物根部迁移性外寄生线虫，可影响根系生长，甚至引起根部生长停滞，导致植物产生短粗根病（stubby root disease）［1-4］。属内的许多种线虫还是一些植物病毒的传播介体，可使许多经济作物如果树、蔬菜、农作物、花卉等造成严重的经济损失，我国已将此类传毒线虫列入进境植物检疫性有害生物名单。如：厚皮拟毛刺线虫是烟草脆裂病毒（TRV）和豌豆早褐病毒（PEBV）的传播介体，主要通过带根苗木、土壤及介质土传播，主要分布在欧洲的部分国家，如英国、爱尔兰、比利时、德国、瑞士、法国、意大利、荷兰等，我国仅在广东有分布［5-7］。该类线虫食性杂，不但直接取食为害寄主植物，而且具有传毒能力，危害较大。

2015年5月，上海出入境检验检疫局从德国进境海棠景观树根际截获一种拟毛刺属线虫，并进行了形态特征观察、PCR检测和序列分析，现将鉴定过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品采集与线虫分离

从进境大型海棠景观树根际深处多点采样，土壤样品约2 kg。室内采用浅盘法分离线虫，将样品置于浅盘中室温浸泡过夜，500目网筛分离线虫，在体视显微镜下镜检。

1.2 形态学特征观察

挑取线虫制成临时玻片，在光学显微镜下进行形态特征观察、测量及拍照，并采用de Man公式对线虫进行测计。

1.3 DNA提取

挑取单条线虫，灭菌水洗涤3次，用挑针捅破或割成多段，使用DNeasy Blood＆Tissue Kit（Qiagen）提取线虫DNA，提取方法按照试剂盒使用说明书进行，获得拟毛刺属线虫样本7520的DNA。

1.4 PCR检测

使用厚皮拟毛刺线虫特异引物UNIVERSAL-F（5’-cccgtcgctactaccgatt-3’）/PACHYREV2-R（5’-gcgtacgggcaatacgatac-3’）采用PCR方法扩增线虫DNA［8］。PCR反应体系包括：10×PCR Buffer（Mg2＋free）2.5μL，Mg2＋（25 mmol/L）2μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2μL，引物（5μmol/L）各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL，ddH2O 16.1μL，总体积25μL。扩增程序为：94℃3 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，35个循环；72℃10 min。预期扩增产物片段大小为329 bp［8］。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。

1.5 18S序列扩增和分析

使用通用引物1091-F（5’-aggaattgacggaagggcac-3’）/1671-R（5’-tcctctaagtaa atcccattgg-3’）扩增线虫DNA的18SRNA部分序列［9-10］，反应体系和扩增程序同1.4，扩增产物送上海生工生物技术服务有限公司进行双向测序，序列核实拼接后和GenBank中相关种序列进行比对分析。基于18S序列，利用MEGA 4.0软件以邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 测计值

厚皮拟毛刺线虫德国群体雄虫、雌虫的测计值见表1及表2。

表1 厚皮拟毛刺线虫（雄虫）德国群体与其他群体的测计值比较Table 1 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♂）and other P.pachydermus（♂）population

表1 厚皮拟毛刺线虫（雄虫）德国群体与其他群体的测计值比较Table 1 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♂）and other P.pachydermus（♂）population

注：长度测量单位为μm

表2 厚皮拟毛刺线虫（雌虫）德国群体与其他群体的测计值比较Table 2 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♀）and other P.pachydermus（♀）population

表2 厚皮拟毛刺线虫（雌虫）德国群体与其他群体的测计值比较Table 2 Com parison ofm easured values between the German population of P.pachydermus（♀）and other P.pachydermus（♀）population

注：长度测量单位为μm

2.2 形态描述

雄虫（图1）：热杀死后角质层显著膨胀。唇区圆，具稍凸起的乳突。瘤针背弓，前部有诱导环。腹中颈乳突1个，位于排泄孔之前；排泄孔位于咽（食道）球的前端。肠前伸背覆盖咽球，咽球内有5个核。单精巢，前伸，精子椭圆形，精子细胞核腊肠形。交合刺细长，末端微腹弯，杆部圆柱形，杆区有横纹，引带与交合刺平行。交合伞狭窄，泄殖腔前有3个腹中交配乳突，SP1、SP2位于交合刺收缩区，SP3位于交合伞前区，相距远。亚腹交配乳突2对，第1对位于肛门后，不明显；第2对位于尾孔前，较大。尾长与肛门处体宽几乎等长。

雌虫（图2）：热杀死后角质层显著膨胀。体前部类似于雄虫。双生殖腺、对伸，受精囊无，精子分布于子宫内。阴门位于虫体中部稍后，阴门后观察到3个侧体孔。阴道近圆形，深度约为体宽的l／3。阴门孔状（腹面观），侧面观阴门骨化结构小，圆三角形到椭圆形，微分离。肛门近尾端，尾非常短，钝圆形。

图1 厚皮拟毛刺线虫（雄虫）形态特征Fig.1 M orphological characters of P.pachydermus（）

图2 厚皮拟毛刺线虫（雌虫）形态特征Fig.2 M orphological characters of P.pachydermus（）

2.3 PCR检测

线虫样本7520的DNA用厚皮拟毛刺线虫特异引物UNIVERSAL-F/PACHYREV2-R进行PCR扩增，获得329 bp的特异性DNA片段，空白对照没有扩增产物（图3）。试验结果表明：线虫样本7520为厚皮拟毛刺线虫PCR阳性。

2.4 18S序列分析和系统发育分析

引物1091-F/1671-R扩增线虫样本7520的DNA获得18S部分序列，长度为570 bp，GenBank登录号为KU052863，与GenBank中厚皮拟毛刺线虫P.pɑchydermus相关序列（FJ040483，AJ439574，AJ439512，JN123367，DQ345525，AF036601）的相似性为99.30%—100%，序列差异为0—4 bp。

根据GenBank中厚皮拟毛刺线虫及其近似种18S序列构建的系统发育树显示，线虫样本7520与P.pɑchydermus位于同一聚类组内（图4）。

图4 基于厚皮拟毛刺线虫18S序列的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 18S sequences of P.pachydermus（Neighbour-Joining，NJ）

2.5 鉴定结果

根据Decraemer等［12-13］建立的毛刺科线虫形态分类多歧检索表，本研究中德国群体的鉴定代码为：雌虫D1-C1-L2-K2-A2（3）-B2-E2-F3-G1-H3-I1-J19-M1-N1-O2-P1-Q1-R2-S1，雄虫F3-D1-P1-A2-B2-C2-E0-G2-H2-I3（1）-J2-K3-L2-M2/7-N1-O1，在多歧检索表中对应的线虫种类均为厚皮拟毛刺线虫。进一步分析，该德国群体的形态特征与已报道的厚皮拟毛刺线虫形态特征基本一致，因此将其鉴定为厚皮拟毛刺线虫；结合PCR检测和序列分析结果，确认德国进境海棠景观树根际截获的拟毛刺属线虫为厚皮拟毛刺线虫（Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus Siddiqi，1974）。

3 讨论

18S序列分析结果表明：厚皮拟毛刺线虫德国群体与P.mɑcrostylus进化关系很近，其与P.mɑcrostylus（AJ439621，AJ439507，AJ439622）的序列相似性为99.82%，序列差异为1 bp（569/570）；与西班牙拟毛刺线虫P.hispɑnus（AJ439577）的序列相似性为98.95%，序列差异为6 bp（564/570）；与胼胝拟毛刺线虫P. porosus（DQ345524）的序列相似性为96.49%，序列差异为20 bp（550/570）。

毛刺科线虫是世界性分布的一类植物寄生线虫，在欧洲和北美的分布最为广泛［2，6］，其传播病毒造成的损失远远大于线虫本身取食造成的危害，因此其作为传毒线虫引起了多国的重点关注。自1960年报道厚皮拟毛刺线虫可以传播烟草脆裂病毒以来，已证实毛刺属5种及拟毛刺属10种线虫为传毒种类［2］。

近年来，随着国际间贸易往来的日益频繁，进出境种苗及其植物繁殖材料越来越多，各种植物病害尤其是线虫病害传播的机会大大增加。如1989年发现于美国弗罗里达州栎属植物根围的Trichodorus velɑtus是随人事操作从欧洲传入本土的，中美和南美报道的毛刺科线虫是随外来植物的引进而带入本土的，其中较多种属于拟毛刺属［2］。一旦检疫性传毒线虫随进境种苗传入我国，将给我国农林生产部门带来严重威胁。

目前，拟毛刺属的形态学鉴定主要依据Decraemer等［12-13］的多歧检索表初步确认到种，再结合具体形态学特征进一步确定，要求鉴定人员具有良好的分类学基础。随着分子生物学技术的发展，PCR技术在植物线虫学领域中的应用愈来愈多，线虫学家已开始尝试采用分子方法来研究该类线虫。本研究详细描述了厚皮拟毛刺线虫形态特征和分子检测技术，旨在为该种类线虫的检疫鉴定提供参考依据。

［1］赵立荣，何日荣，武目涛，等.从日本进境的景观植物根际截获的两种毛刺线虫［J］.植物检疫，2014，28（2）：15-24.

［2］李戌清.毛刺线虫科（Trichodoridae）一些种群形态及分子系统学研究［D］.杭州：浙江大学，2010.

［3］王寿华，缪作清，张景凤.苹果短粗根病的发生及病原线虫种的鉴定［J］.植物病理学报，1994，24（1）：62-66.

［4］林丽飞，李卫芬，胡先奇，等.绣球花短粗根病病原线虫的种类鉴定［J］.植物保护，2009，35（2）：131-133.

［5］杜宇，蒋小龙，葛建军，等.GB/T 24830—2009拟毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［6］杜宇，朱水芳，周剑，等.中国进境植物检疫性传毒线虫评价［J］.植物检疫，2008，22（5）：300-305.

［7］黎少梅，冯志新.广东省为害菠萝和菠萝根际线虫的种类调查和鉴定［J］.华南农业大学学报，1995，16（2）：44-51.

［8］BOUTSIKA K，PHILLIPSM S，MACFARLANE SA，et al.Molecular diagnostics of some trichodorid nematodes and associated Tobacco rattle virus［J］.Plant Pathology，2004，53（1）：110-116.

［9］DUARTE IM，DE ALMEIDA M TM，BROWN D JF，et al.Phylogenetic relationships，based on SSU rDNA sequences，among the didelphic genera of the family Trichodoridae from Portugal［J］.Nematology，2010，12（2）：171-180.

［10］KUMARIS，SUBBOTIN SA.Molecular characterization and diagnostics of stubby root and virus vector nematodes of the family Trichodoridae（Nematoda：Triplonchida）using ribosomal RNA genes［J］.Plant Pathology，2012，61（6）：1021-1031.

［11］HUNTD J.Aphelenchida，Longidoridae and Trichodoridae-Their Systematics and Bionomics［M］.United Kingdom（Albans）：Wallingford（UK）CAB International，1993：277-279.

［12］DECRAEMERW，BAUJARD P.A polytomous key for the identification of species of the family Trichodoridae Thorne，1935（Nematoda：Triplonchida）［J］.Fundamental and applied Nematology，1998，21（1）：37-62.

［13］DECRAEMERW，BAUJARD P.Additions and corrections to：Decraemer：The Family Trichodoridae［J］.Fundamental and applied Nematology，1998，21（2）：207-212.

（责任编辑：闫其涛）

Identification of Paratrichodorus pachydermus in the rhizosphere of cherry-app le tree im ported from Germany

SONG Shao-yi，LIU Jing-yuan，XU Shen-yu，QILong-jun，YU Cui，YIJian-ping*
（Shɑnghɑi Entry-Exit Inspectionɑnd Quɑrɑntine Bureɑu，Shɑnghɑi200135，Chinɑ）

One species of Pɑrɑtrichodorus nematode was isolated from rhizosphere of cherry-apple tree imported from Germany at Shanghai Port.Female nematode was didelphic，lack of spermatheca.Its sperm was dispersed throughout the uterus and pore-like vulva rounded triangular or oval，with small vaginal sclerotized pieces.Male nematode had one ventromedian cervical papillae in front of excretory pore，large sperm cells with large sausage-shaped nucleus，distal end of spicule nearly straight，spicules shaft with striation，arrow bursa and three ventromedian precloacal supplements.PCR amplification was positive with specific primers for P. pɑchydermus.Sequence analysis revealed that its 18S-sequence had 99.30%—100%identity with P. pɑchydermus in GenBank.Phylogenetic tree of the 18S sequences showed this species clustered with P. pɑchydermus.Based on the morphological characteristics，PCR detection and sequence analysis，this kind of nematode was identified as P.pɑchydermus.This is the first report of interception of P.pɑchydermus in China.

Pɑrɑtrichodorus pɑchydermus；Virus-vector；Phylogeny；Identification

S41；S685

A

1000-3924（2017）01-079-05

2015-09-29

上海出入境检验检疫局科技项目（HK004-2014）；上海市绿化和市容管理局攻关项目（G152427）

宋绍祎（1971—），女，本科，高级农艺师，主要从事检疫性线虫的检测鉴定。E-mail：songsy＠shciq.gov.cn

*通信作者，Tel：021-38620575，E-mail：yijp＠shciq.gov.cn