抗EGFR/CD3双特异性抗体的制备与功能的初步研究

车耀健， 赵宁宁， 胡 妍， 杨丰云， 温振国

近年来，以PD-1/PD-L1抗体为代表的免疫治疗为攻克癌症带来了革命性突破，2个或多个肿瘤免疫靶点药物联合使用是免疫治疗的发展方向。双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)可同时识别并结合2个不同靶点，是肿瘤免疫治疗领域中的一个研发热点[1]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)广泛分布于各组织，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，其过表达与肿瘤的发生发展、放疗或化疗敏感度以及预后密切相关[2]，抗EGFR抗体药物西妥昔单抗(Cetuximab)和尼妥珠单抗(Nimotuzumab)均已上市，用于治疗EGFR+肿瘤。而CD3主要表达于T细胞表面，T细胞与抗CD3抗体(如OKT3[3])结合后能够活化T细胞。EGFR与CD3均为肿瘤免疫重要的分子。本研究尝试通过BsAb的方式将这2种分子的抗体进行关联，从而提高靶向杀伤效果。目前构建BsAb的方法有很多种，如化学偶联、tandem diabody(tandAB)、dual affinityre-targeting(DART)、BiTE、Dock and Lock(DNL)、CrossMAb、knobs-into-holes等[1,4-10]。其中在knobs-into-holes模式中，knob链形成的结构能够特异地插入到hole形成的结构中，从而能够获得异源二聚体的BsAb，同时CD3单链抗体无完整轻链，不会与EGFR抗体的重链错配而失去活性。因此本研究通过knobs-into-holes的方式进行研究，将2个进入临床Ⅱ期研究后中止开发的anti-EGFR抗体(Matuzumab)及anti-CD3单链抗体(HuM291)通过knobs-into-holes的方式组合起来制备BsAb，并通过体外实验初步验证anti-EGFR/CD3抗体的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞和试剂 质粒载体pXC17.4和pXC18.4(瑞士Lonza公司)，基因序列由上海生工生物工程有限公司合成。EGFR+的CHO细胞系、Jurkat细胞系(T淋巴瘤细胞系)、U87 Ⅷ(脑胶质瘤细胞系)、HCT-116细胞系(结肠癌细胞系)、Expi 293F悬浮细胞系均由本实验室保存。ExpiFectamine 293 Transfection kit(批号：1870295，美国Thermo Scientific公司)，EcoR Ⅰ限制性内切酶(批号：AG50083A，日本Takara公司)，Hind Ⅲ限制性内切酶(批号：AG50147A，日本Takara公司)，T4 DNA连接酶(批号：1181608，美国NEB生物技术有限公司)。质粒大量提取试剂盒(批号：1502/002，德国Macherey-Nagel公司)，10×PBS(批号：13515002)和DMEM(批号：1676986)(美国Corning公司)，HiTrap mabselect SuRe 1 mL层析柱(批号：10233639)及superdex 200 increase 10/300分子筛层析柱(批号：10240183)(美国GE Health Care公司)，Acqutiy UPLC Protein BEH SEC Column 1.7 μm分子筛分析柱(批号：023370531，美国Waters公司)，PE标记的CD3抗体(批号：4285682)及APC标记的CD69抗体(批号：B200047)(美国BD公司)。

1.1.2仪器 CO2细胞培养箱(型号：311，美国Thermo Scientific公司)，AKTA蛋白纯化系统(型号：AKTA avant 25，美国GE Health Care公司)，凝胶成像系统(型号：ChemiDocTMXDR+，美国Bio-Rad公司)，超高效液相色谱仪(UPLC)(型号：Acquity H-class，美国Waters公司)，流式细胞仪(型号：FACSVerse，美国BD公司)，实时无标记细胞功能分析仪(型号：xCELLigence RTCA DP，美国艾森生物公司)。

1.2方法

1.2.1BsAb EGFR/CD3表达质粒构建 首先在生工生物工程有限公司合成表达anti-EGFR重链和轻链的基因序列，构建成正常的anti-EGFR抗体(图1A)，同时合成与FC融合的anti-CD3的单链抗体anti-CD3-scFV的基因序列，构建成anti-CD3-scFV抗体(图1B)，其中scFV是将CD3抗体的重链可变区和轻链可变区用linker(4个G4S)连接起来。基因合成后将重链基因连入到pXC17.4载体中，轻链基因连入pXC18.4载体中。而构建BsAb质粒需要knob链和hole链2条链参与，其中knob链是将anti-EGFR重链的第354位氨基酸S突变成C(S354C)，以及第366位氨基酸T突变成W(T366W)，获得携带anti-EGFR-HC-knob基因的质粒；而hole链则是将anti-CD3-scFV进行如下氨基酸突变：Y349C，T366S，L368A，Y407V[11-12]，从而获得携带anti-CD3-scFV-HC-hole基因的质粒，二者同时与携带anti-EGFR-LC基因的质粒共转染，最终构成knobs-into-holes的抗体模式(图1C)。

1.2.2ExpiFectamine 293法转染Expi 293F悬浮细胞 将携带重链和轻链基因的重组质粒按等量的比例转染至Expi 293F悬浮细胞中，具体步骤如下：首先用Opti-MEM培养基稀释45 μg DNA至2.25 mL、稀释ExpiFectamine 293 Reagent至2.25 mL，室温静置5 min，二者混合后静置20 min。将DNA-Reagent复合物加入密度为7.5×107mL-1的细胞中(共38.25 mL)，16～18 h后加入225 μL Enhancer 1及2.25 mL Enhancer 2，约72 h后收集细胞上清。

1.2.3抗体纯化及分析 将细胞上清过滤后采用Protein A亲和层析的方法进行初纯：HiTrap mabselect SuRe 1 mL柱子用PBS平衡5个柱体积，20 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3.5)洗脱，收集第1个抗体峰，收集到的样品再用十分之一体积的1 mol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH=9.0)进行中和。超滤管浓缩，再用superdex 200 increase 10/300分子筛进行精细纯化，流动相为PBS，流速为0.75 mL/min，收集主峰位置的样品，得到目的抗体。将3种抗体浓度均定量至1 mg/mL左右，各取15 μL样品分别加入非还原性loading buffer和还原性loading buffer(含巯基乙醇)，95 ℃加热5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。采用UPLC系统进行分析，分析柱为Acqutiy UPLC Protein BEH SEC Column，流动相为PBS，流速为0.4 mL/min。

A：anti-EGFR；B：anti-CD3-scFV；C：anti-EGFR/CD3.图1 不同抗体的结构示意图Fig 1 The schematic diagram of the different antibodies

1.2.4BsAb体外结合能力评价 将3种抗体分别与Jurkat细胞系(T淋巴瘤细胞系，CD3+)，U87Ⅷ(脑胶质瘤细胞系，EGFR+)，HCT-116细胞系(结肠癌细胞系，EGFR+)进行体外结合实验。收集细胞至流式管中，2 000 r/min离心3 min，弃上清；向各流式管中加入2 mL含1%胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，以2 000 r/min的速度离心3 min，弃上清；轻轻将管底细胞悬起，向各管加入需要检查的抗体，4 ℃孵育20 min后，加入2 mL含1%胎牛血清的PBS，2 000 r/min离心3 min，弃上清；再加入标记PE的二抗，4 ℃孵育20 min后，加入2 mL含1%胎牛血清的PBS，2 000 r/min离心3 min，弃上清；向各管加入300 μL含1%胎牛血清的PBS，上流式细胞仪检测。

1.2.5T细胞活化 分离3个正常人血液中的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，每份进行3个重复实验，分盘后(每孔1 mL)分别加入20 μm的anti-EGFR、20 μm的anti-CD3-scFV、40 μm的anti-EGFR/CD3抗体，于37 ℃的CO2孵箱中培养24 h，同时用PE标记的CD3抗体和APC标记的CD69抗体染色进行流式细胞检测。

1.2.6体外杀伤实验 采用xCELLigence RTCA DP实时无标记细胞功能分析仪进行检测，实时监测细胞状态，通过细胞指数(cell index)读值反应活细胞的数量，数值越高，活细胞数量越多。已有用此法进行抗体依赖的细胞毒活性等细胞活性方面的检测[13]。具体步骤如下：huPBMC分别分离自3个健康人，加入Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads(磁珠∶细胞=1∶1)刺激活化T细胞，然后接种40 000个HCT-116细胞至仪器专用的细胞培养盘上(每份T细胞进行3孔重复)，在第25 小时加入磁珠活化后的T细胞(其中效应细胞∶肿瘤细胞=5∶1)以及抗体(每孔抗体用量分别是：40 μm anti-EGFR/CD3，20 μm anti-EGFR，20 μm anti-CD3-scFV，20 μm anti-EGFR+20 μm anti-CD3-scFV)，37 ℃继续培养，每15 min收集1次信号。按以下公式计算细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)的杀伤率：

CTL的杀伤率(%)=(对照组读值-实验组读值)/对照组读值×100%

1.3统计学处理 采用GraphPad Prism 5进行统计学分析，采用单因素ANOVA进行显著性检验，2组间均值比较采用独立样本t检验。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1纯化与分析结果 经Protein A纯化后，只收集到1个单一的洗脱峰，中和后浓缩进行分子筛纯化，在上样后12 min左右收集主峰，得到了目的抗体。SDS-PAGE结果显示，BsAb的条带位置(泳道1)居于正常抗体(泳道2)和单链抗体(泳道3)中间(图2A)，说明BsAb构成的是异源二聚体；anti-EGFR/CD3二聚体比anti-EGFR正常抗体少1个轻链，因此还原性SDS-PAGE中轻链位置(25 kD左右)泳道2比泳道1条带更粗(图2B)，浓度更高，同时anti-CD3-scFV轻链位置没有条带，进一步说明获得的抗体是异源二聚体。

UPLC系统分子筛分析鉴定结果如图3，anti-CD3-scFV，anti-EGFR及anti-EGFR/CD3的保留时间分别为3.169，2.906及3.013 min，其中anti-EGFR/CD3的保留时间刚好居于2个抗体之间，且纯度都>99%，从另一方面证明本实验获得高纯度的异源BsAb。

A：非还原性；B：还原性. 1：anti-EGFR/CD3；2：anti-EGFR；3：anti-CD3-scFV；M：蛋白marker.图2 3个抗体的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果Fig 2 The results of the SDS-PAGE of the three antibodies

图3 3个抗体的UPLC分子筛分析Fig 3 The SEC results of UPLC

2.2体外结合能力评价 anti-EGFR/CD3能够与EGFR+的U87 Ⅷ细胞系和HCT-116细胞系结合，结合能力与anti-EGFR单克隆抗体相当(图4A)。anti-EGFR/CD3也能够与CD3阳性的Jurkat细胞结合，但相对于单独的anti-CD3-scFV结合能力更弱一些(图4B)。结果表明BsAb能同时识别EGFR和CD3两种抗原。

2.3T细胞活化实验 CD69在细胞活化的过程中起了非常重要的作用，是T细胞活化的一个重要标志物，因此可以通过观察T细胞表面是否表达CD69来判断T细胞是否活化。将分离得到的PBMC分别用抗体刺激，24 h后进行流式细胞检测，结果如图5所示。与对照比较，加入anti-EGFR/CD3后CD69+的T细胞比例(P<0.000 1)以及anti-CD3-scFV刺激后的比例(P<0.000 1)均明显高于不加抗体对照，表明anti-CD3-scFV和anti-EGFR/CD3都能较好地刺激T细胞活化。

A：EGFR+； B：CD3+细胞.图4 体外结合能力比较Fig 4 Comparison of the binding assay in vitro

2.4T细胞体外杀伤能力评价 实时无标记细胞功能分析仪能实时监控活细胞的数量，在不加T细胞和抗体(Mock)或只加抗体不加T细胞的情况下，肿瘤细胞生长曲线呈上升趋势，活细胞数量不断增加，直到平台期才停止(图6A)；而在第25小时加入T细胞后，无论有没有加抗体，曲线均往下降，出现了不同程度的细胞死亡，其中BsAb anti-EGFR/CD3下降最为明显。以第25小时作为零点，分别取加入抗体后12和24 h的数据进行统计学分析(图6B)，anti-EGFR/CD3在12 h后的杀伤率均明显高于不加抗体的T细胞对照组和其他抗体(均为P<0.000 1)。同样，观察杀伤24 h后的情况，依然是anti-EGFR/CD3杀伤效果最好。

1：anti-EGFR； 2：anti-CD3-scFV； 3：anti-EGFR/CD3； 4：T cell only.图5 抗体对T细胞的活化作用结果Fig 5 Activating effect on T cells of the antibodies

A：无标记细胞功能分析仪细胞实时监测图； B：T细胞杀伤率比较. 1：T cell only；2：anti-EGFR/CD3； 3：anti-CD3-scFV+anti-EGFR； 4：anti-CD3-scFV；5：anti-EGFR. ☆☆☆:P<0.000 1.图6 对肿瘤细胞体外杀伤效果Fig 6 Killing effect on tumor cells in vitro

3 讨 论

当今，免疫治疗技术越发成熟，已经广泛应用于临床，渐渐成为继传统化疗、放疗之后内科治疗肿瘤的又一有力武器。而针对EGFR介导的信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用，许多实体肿瘤中均存在EGFR的高表达或异常表达[14]。因此，以EGFR作为治疗靶点的方案也越来越多，其中以ABX-EGF、IMC-C225(Cetuximab)、MAB528、MAB225，Matuzumab为代表的单抗类药物为肿瘤的治疗提供了新的希望[15-17]。但是，单纯的抗体治疗可能并不能很好地发挥治疗作用，还需要免疫细胞的配合。肿瘤免疫微环境的异质性会影响肿瘤的治疗反应，免疫微环境作为肿瘤微环境有机整体的重要组成部分，其所起的作用越来越受到重视[18]。肿瘤浸润T细胞是免疫微环境的一个重要指标，肿瘤体内杀伤效果不佳，其中一个重要的原因可能就是肿瘤组织内的效应T细胞数量太低或活性太差。因此，治疗过程中需提供适合免疫细胞的肿瘤微环境。本研究利用已完成临床Ⅰ期安全性研究但止步于临床Ⅱ期有效性研究的2个失败的抗体药物Matuzumab和HuM291，通过knobs-into-holes技术获得anti-EGFR/CD3双特异性抗体。在杀伤肿瘤的过程中，加入双特异性抗体的杀伤效果明显高于其他对照组，而单独的抗体或单纯将2种抗体混合到一起，杀伤效果不如BsAb，推测可能是因为BsAb能够同时结合T细胞和肿瘤细胞，起到桥连的作用，能够特异性地将效应细胞与肿瘤细胞的距离拉近，在抗体靶向肿瘤的过程中，能够结合效应细胞，将其带到肿瘤细胞周围并累积，从而起到募集效应细胞的作用。同时CD3抗体能进一步激活效应细胞，提供一个很好的免疫微环境(肿瘤浸润T细胞等)。另外，正常的免疫细胞需要抗原呈递，并形成MHC-抗原复合物结合T细胞受体才能发挥杀伤作用，BsAb能使T细胞直接跳过这一过程，直接与肿瘤细胞接触，杀伤肿瘤细胞，从而达到预期的目的。

本研究采用的是knobs-into-holes的模型，获得的抗体比一般的化学偶联方式更稳定，成本更低。虽然在体外结合能力和杀伤能力方面都有一定的效果，但由于缺乏动物模型，未能评价体内治疗效果。因此，笔者接下来的工作可以尝试构建合适的动物模型，将此BsAb用于小鼠体内实验，观察治疗效果。虽然抗EGFR抗体用于肿瘤治疗已取得了一些可喜的进展，但其效果并不令人满意，且具有各种各样的不良反应。因此，本研究所用的EGFR抗体存在一定局限性。另外，BsAb与CD3的结合能力比anti-CD3-scFV弱，可能是由于异源BsAb中的EGFR抗体部分存在一定的空间位阻，而anti-CD3-scFV是同源二聚体，位阻更小，具有更好的结合能力，从而导致BsAb结合CD3的能力比anti-CD3-scFV更弱。综合来看，anti-EGFR/CD3的结合能力和杀伤效果还有待进一步提高，而筛选效果更好的EGFR和CD3抗体以及尝试不同的肿瘤细胞靶点是接下来研究的方向之一，使获得的双特异性抗体既可很好地将效应细胞募集到肿瘤组织，又可更好地激活效应细胞，提高效应细胞的杀伤效果，从而大大改善治疗效果，为肿瘤的免疫治疗奠定一定的基础。

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