玳玳果降脂提取物中大孔吸附树脂有机残留量的顶空气相色谱分析研究

马国萍， 陈 丹， 黄 群， 谢 平， 朱仙慕， 黄 娇， 查珍珍

玳玳(CitrusaurantiumL.vardaidaiTanaka)属芸香科柑桔亚属植物，为酸橙的变种，药食同源。玳玳性微寒，味苦、酸，具有疏肝和胃、理气止痛、行气宽中、消食化痰之功效[1-2]。课题组前期研究表明，闽产玳玳果中含有黄酮、生物碱、挥发油等化学成分[3-5]，采用已获国家发明专利授权的工艺制备的玳玳果黄酮有效部位玳玳果黄酮降脂提取物具有良好的降脂抗氧化作用，提取物总黄酮含量>80%；玳玳果黄酮降脂提取物的纯化工艺运用了AB-8大孔吸附树脂分离[6-10]。根据国家食品药品监督管理局对大孔树脂最新规定，凡在生产工艺中使用过大孔吸附树脂的制剂或原料，应对其可能引入的单体(苯乙烯)、交联剂(二苯乙烯)及致孔剂(烃类)等控制其残留量。因此，为确保产品玳玳果降脂提取物的质量安全稳定，本研究拟建立玳玳果降脂提取物中检测大孔吸附树脂6种有机残留物苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷的顶空气相色谱法，并在已建立的色谱条件下，检定3批玳玳果降脂提取物大孔树脂的有机溶剂残留量，为完善玳玳果降脂提取物质量控制方法奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 气相色谱仪(Agilent 6890N)，氢火焰检测器(FID，Agilent 6890N)，Agilent 6890N色谱工作站均为美国安捷伦科技公司。

1.1.2试药 苯乙烯对照品(standard for GC，>99.5%,上海麦克林生化科技有限公司)；二乙烯苯对照品(≥99.5%，国药集团化学试剂有限公司)；苯对照品(≥99.5%)、甲苯对照品(≥99.5%)、二甲苯对照品(≥99.5%)，均为上海联试化工试剂有限公司；正己烷对照品(≥98.0%，国药集团化学试剂有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市致远化学试剂有限公司)；双蒸水(自制)；玳玳果降脂提取物(自制，批号20170324，20170325，20170326)。

1.2方法

1.2.1色谱条件与系统适用性试验 顶空进样系统程序升温法；色谱柱DB-WAX石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID检测器，温度230 ℃，进样口温度210 ℃；程序升温：柱温在70 ℃维持8 min，再以10 ℃/min的升温速率升至160 ℃，再以30 ℃/min的速率，继续升温至220 ℃，恒温3 min；以氮气为载气，流速为3.0 mL/min；尾吹气50 mL/min；空气300 mL/min；氢气30 mL/min；进样量50 μL，不分流进样；顶空平衡温度90 ℃，平衡时间30 min。在上述色谱条件下，检测苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷各成分是否分离完全。

1.2.2供试品溶液的制备 精密称取玳玳果降脂提取物粉末约0.8 g，置20 mL顶空瓶中，精密加入2.0 mL DMF溶解，密封瓶口，摇匀，即得。

1.2.3混合对照品溶液的制备 精密称定苯乙烯、二乙烯苯、苯、甲苯、二甲苯、正己烷对照品适量，分别放置于10 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(苯8.297 mg/mL,甲苯58.715 mg/mL，二甲苯66.484 mg/mL，正己烷53.665 mg/mL，苯乙烯47.077 mg/mL，二乙烯苯114.448 mg/mL)。

分别精密吸取苯乙烯对照品储备液3.0 mL，二乙烯苯对照品储备液8.0 mL，苯对照品储备液4.0 mL，甲苯对照品储备液3.0 mL，二甲苯对照品储备液2.5 mL，正己烷对照品储备液6.5 mL，于50 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，再从中精密吸取290 μL，于25 mL量瓶中加DMF稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.4标准曲线制备及线性关系考察 精密量取混合对照品溶液185，300，600，900，1 200，1 500，1 800 μL，放置于5 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，并分别精密量取2.0 mL置于20 mL顶空瓶中，密封瓶口，摇匀，测定。以峰面积为纵坐标Y，质量浓度为横坐标X(μg/mL)，进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.5检测限(limit of detection, LOD)及定量限(limit of quantitation, LOQ)考察 将苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷各对照品储备液分别逐步稀释，按照对照品溶液色谱图中的各成分峰高折算，直到检测峰高为基线噪声的3 倍左右为止(即S/N=3)，计算各个成分的最低检测限。当检测峰高为基线噪声的10 倍左右(即S/N=10)，计算各成分的最低定量限。

1.2.6精密度试验 分别精密量取同一份混合对照品溶液2 mL，共6 份(每1 mL含正己烷0.598 μg，苯0.924 μg，甲苯4.904 μg，二甲苯4.627 μg，苯乙烯3.932 μg，二乙烯苯25.490 μg)，置于20 mL顶空进样瓶中，密封瓶口，摇匀，按1.2.1项方法操作，测定，记录各个有机残留溶剂的峰面积，计算RSD。

1.2.7重复性试验 分别精密称取同一批(批号20170324)的玳玳果降脂提取物粉末约0.8 g，6 份，按1.2.2及1.2.1项方法操作，检测各有机残留组分，计算含量及RSD值。

1.2.8加样回收率试验 分别精密称取同一批(批号20170324)已知含量的玳玳果降脂提取物粉末约0.4 g，共6 份，加入混合对照品溶液(每1 mL含正己烷1.809 μg；苯0.732 μg；甲苯4.781 μg；二甲苯4.237 μg；苯乙烯4.926 μg；二乙烯苯58.60 μg)2.0 mL，按1.2.2及1.2.1项方法操作，测定，记录各有机残留溶剂的峰面积，计算各有机溶剂的平均回收率。

1.2.9样品测定 取3批玳玳果降脂提取物(批号20170324，20170325，20170326)，分别精密称取玳玳果降脂提取物粉末约0.8 g，每批3 份，按1.2.2及1.2.1项方法操作，测定，计算各批大孔吸附树脂有机残留量。

2 结 果

2.1标准曲线的制备及线性关系考察 大孔吸附树脂各残留有机溶剂标准曲线回归方程及线性范围见表1，图1。结果表明，大孔吸附树脂各残留有机溶剂在范围内线性关系良好。

A:正己烷； B:苯； C:甲苯； D:二甲苯； E:苯乙烯； F:二乙烯苯.图1 大孔吸附树脂各残留有机溶剂标准曲线图Fig 1 Standard curves of residual organic solvents in macroporous adsorption resins

2.2LOD及LOQ考察 各个成分的最低LOD分别为苯6.26 ng(S/N=3.3)，甲苯14.74 ng(S/N=3.6)，二甲苯14.63 ng(S/N=2.5)，苯乙烯25.26 ng(S/N=3.8)，二乙烯苯190.61 ng(S/N=2.9)，正己烷93.44 ng(S/N=3.1)。

各成分的最低LOD分别为苯12.53 ng(S/N=11.6)，甲苯59.25 ng(S/N=12.8)，二甲苯58.37 ng(S/N=11.5)，苯乙烯50.25 ng(S/N=10.4)，二乙烯苯383.53 ng(S/N=9.4)，正己烷124.58 ng(S/N=10.2)。

2.3精密度试验 同一份混合对照品溶液连续测定6次，测定各有机残留溶剂的峰面积值的相对标准偏差RSD为4.21%～6.47%，均<10.0%，精密度符合要求(表2)。

2.4重复性试验 以正己烷残留组分量为检测评价指标，测得其平均含量0.006 589%(RSD=2.52%，n=6)，方法重复性良好(表3)。

表1 残留有机溶剂含量测定线性范围及回归方程

表2 各有机残留组分精密度试验峰面积结果

表3 有机残留组分重复性试验结果

2.5加样回收率试验 建立的玳玳果降脂提取物中大孔吸附树脂6 种有机残留物苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷含量测定方法，准确度良好。结果表明，各残留有机溶剂加样回收率均符合《中国药典》(2015年版)四部对残留溶剂测定法项下的规定，即RSD不大于10%的要求[11](表4)。

2.6样品测定 3批玳玳果降脂提取物样品中均检测出正己烷成分，其质量分数分别为0.000 693%，0.000 671%和0.000 687%，均符合《中国药典》(2015年版)四部残留溶剂测定法项下正己烷残留限度不得超过0.029%的规定[11]，未检出苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等(表5，图2)。

3 讨 论

大孔吸附树脂技术在中药分离纯化中起着重要的作用，树脂表面和孔隙中未聚合的单体(苯乙烯)、交联剂(二乙烯苯)及致孔剂(烃类)，在生产过程中被带入药品中会影响药品和食品的安全性。ICH(药品注册的国际技术要求)规定溶剂残留限度苯为不得超过0.000 2%，甲苯0.089%，二甲苯0.217%，正己烷0.029%，对苯乙烯、二乙烯苯未明确[12]。参考国家食品药品监督管理局《大孔吸附树脂分离纯化中药提取液的技术要求(暂行)》及补充说明，将残留物的限度定为每克样品含苯不得超过2 μg，含正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均不得超过20 μg。

表4 加样回收率试验结果

表5 样品测定结果

A:对照品溶液； B:空白溶液； C:样品溶液. 1:正已烷； 2:苯； 3:甲苯； 4:二甲苯； 5:苯乙烯； 6:二乙烯苯； 7:N,N-二甲基甲酰胺.图2 玳玳果降脂提取物树脂残留物气相色谱图Fig 2 Resin residue gas chromatogram

顶空气相色谱法采用气体直接进样的方式，无需有机溶剂提取，从而避免了在直接液体或固体取样时，复杂样品基体成分一起被带入分析系统的可能性，由此消除了由基体成分的带入而对样品中可挥发性成分分析所造成的影响和干扰，对色谱柱污染小，得到的谱图简单。实验采用顶空气相色谱法检测玳玳果降脂提取物大孔吸附树脂有机残留物，结果表明，该提取物中均未检出苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等有机溶剂，检测出的正己烷的残留量不超过0.029%，均符合要求。因此，采用课题组已获国家发明专利授权的方法以AB-8大孔吸附树脂纯化制备玳玳果降脂提取物工艺是安全的。

二甲苯、二乙烯苯是性质不稳定容易发生聚合的复杂混合物，在色谱图中可表现有3,6个色谱峰，分别为其各自邻、间、对位异构体的色谱峰。因无法得到其单一成分的对照品，所以在实验中以其相应峰面积和定量，并以其中含量最大组分的LOD作为各自的LOD。大孔吸附树脂残留溶剂允许限度较低，实验中配制的对照品溶液浓度较低，建立的玳玳果降脂提取物大孔吸附树脂有机残留量检测方法在精密度试验、重复性试验及加样回收率试验等方法学考察结果，均符合《中国药典》(2015年版)四部对残留溶剂测定法项下的规定，即RSD不大于10%的要求。

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