SFPQ在肝细胞癌组织中的表达及其对BEL-7402细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

庄雄标， 陈淑珍， 黎丰华， 刘献棠， 吴印爱, 王志伟

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是我国常见的恶性肿瘤，其中85%～90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。虽然目前HCC的治疗方法较多，但5年复发率仍高达75%～100%[3]。研究HCC发生发展的分子机制，寻找新的可用于预测HCC转移复发和靶向治疗的标志物，具有重要意义。

脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子(splicing factor proline and glutamine rich, SFPQ)，又名多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein，PTB)相关剪接因子(PTB-associated splicing factor，PSF)，是果蝇行为/人类剪切(drosophila behavior human splicing，DBHS)蛋白家族的一员，它与剪接调控蛋白PTB一起，参与前体mRNA的剪接过程，并因此得名[4]。然而，SFPQ蛋白的功能不尽于此。研究发现，绝大部分SFPQ蛋白定位于细胞核浆，不与PTB结合，在转录调控、DNA链的解旋和配对中发挥重要作用[5]。同时，SFPQ蛋白参与构成一种目前功能未知的结构Paraspeckles[6-7]。此外，SFPQ还参与了肿瘤细胞生长和转移的调控[8-9]。在增殖期细胞，SFPQ的表达较静止期细胞提高两倍[8]。在前列腺癌组织中，SFPQ蛋白的表达较癌旁组织下调，其低表达与前列腺癌的进展显著相关[10]。而在结直肠癌中，虽然SFPQ参与结直肠癌的生长和转移进程，但与癌旁组织相比，其在癌组织中的表达并无显著改变[11]。

本研究拟通过免疫组织化学染色检测SFPQ蛋白在HCC患者癌与癌旁组织中的表达，并利用Oncolnc数据库分析SFPQ在HCC患者预后判断中的价值。同时通过小干扰RNA技术体外敲低SFPQ在肝癌细胞株BEL-7402中的表达，探讨SFPQ对肝癌细胞增殖、迁移侵袭、EMT等生物学特性的影响及其在HCC发生发展中可能的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本 组织标本来自2013—2016年笔者医院普通外科行HCC根治性切除术的30名患者，所有患者术前均未接受抗肿瘤治疗。癌组织为距病灶边缘<1 cm的组织，术后经病理学检查证实为HCC;癌旁组织为肿瘤边缘>2 cm的组织。

1.1.2试剂 SFPQ兔多克隆抗体(货号：15585-1-AP，美国 Proteintech 公司)；柠檬酸抗原修复液(货号：ZLI-9065，北京中杉金桥公司)、免疫组织化学一步法检测系统(货号：PV-6000，北京中杉金桥公司)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(货号：ZLI-9018，北京中杉金桥公司)；RNAiso试剂(货号：9180)、逆转录试剂盒(RR036A)和荧光定量PCR试剂盒(RR420A)(日本Takara公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(货号：11668-019，美国Invitrogen公司)；DMEM培养基(货号：12100046，美国Gibco公司)、胎牛血清(货号：10270160，美国Gibco公司)；CCK8细胞增殖检测试剂盒(货号：BB4202，南京贝博公司)；Matrigel基质胶(货号：356234，美国Cornirng公司)、Transwell培养板(货号：3415，美国Cornirng公司)；结晶紫粉末(C6158，美国 Sigma 公司)；E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Snail和GAPDH 兔多克隆抗体(货号：A3044，A3045，A5544，A2666，AC001，美国Abclonal公司)；HRP标记山羊抗兔二抗(货号：D110058，上海生工公司)。

1.1.3仪器 LightCycler 480 II System(5015278001型，瑞士Roche公司)；Western-blot蛋白检测系统(1645050型，美国Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法检测SFPQ蛋白在肝细胞癌组织中的表达 石蜡标本制作成4 μm厚度切片，常规烤片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，微波修复10 min，3%过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶15 min，4 ℃过夜孵育一抗(1∶200)，次日经PBS充分洗涤，孵育二抗30 min，DAB镜下显色，苏木精复染细胞核，氨水返蓝后常规封片。

免疫组织化学结果判断标准：按着色强度将无着色、轻度着色、中度着色及深度着色记为0，1，2和3分；按阳性肝癌细胞占总肝癌细胞比例，将0%，1%～25%，26%～50%，51%～75%%及≥76%记为0，1，2，3及4分；两者的乘积代表组织SFPQ蛋白的表达水平，总分为0～12分[12]。

1.2.2OncoLnc数据库进行在线生存分析 利用OncoLnc数据库(http://www.oncolnc.org/)中的HCC数据集，按照推荐设置(Top33%：Bottom33%)进行不同SFPQ表达水平患者间的生存分析[13]。

1.2.3细胞培养 肝癌细胞BEL-7402使用含10% 胎牛血清DMEM高糖培养基，置于含体积分数为0.05%的CO2、37 ℃饱和湿度环境中进行培养。siRNA转染BEL-7402细胞委托上海吉玛公司设计并合成siRNA序列，分别为：

siRNA-1 sense：GCAAAGGATTCGGATTTAT

antisense：GCAGGATTCGGATTAATAT

siRNA-2 sense：CCTTTCTGTTCGTAATCTT

antisense：CCTCTGTTCGTAATTTCTT

阴性对照 sense：CCAGCAGCAAGAAAGGCAT

antisense：CCAACGAAAGAGGACGCAT

转染前1天将对数生长期的BEL7402细胞按照每孔4×105接种至6孔板，常规培养至融合度达60%～70%，按照Lipofectamine 2000说明书进行siRNA细胞转染，实验设置分为：空白组(Blank)，阴性对照组(negative control，NC)，siRNA-1组(KD1)及siRNA-2组(KD2)。

1.2.4荧光定量PCR法验证SFPQ低表达细胞模型 细胞转染48 h后，按照RNAiso试剂说明书提取细胞总RNA，以所提取的总RNA为模板按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，采用 SYBR Green I 法进行荧光定量PCR反应，反应条件为预变性95 ℃，30 s→变性95 ℃，5 s→退火60 ℃，30 s，变性和退火共45个循环，溶解曲线和降温条件按照说明书进行设置。引物由上海生工公司设计并合成，SFPQ序列为：

forward：5′-TGGCTGAAATTGCCAAAGCC-3′

reverse：5′-GGCGCAAAAGATTTGCCTGA-3′

以GAPDH为内参，序列为：

forward：5′- CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′

reverse：5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′

1.2.5CCK8法检测SFPQ表达敲低后BEL-7402细胞增殖能力的变化 细胞转染24 h后，按每孔1×103接种于96孔板，分别在0，24，48，72，96 h加入10 μL CCK8试剂，37 ℃孵育2 h，选择450 nm波长测定吸光度，绘制生长曲线。

1.2.6Transwell法检测SFPQ表达敲低后BEL-7402细胞迁移和侵袭能力的变化

1.2.6.1细胞迁移实验 细胞转染48 h后，收集并以无血清培养基重悬细胞，按照每孔5×104接种于Transwell 上室，下室加入含10%胎牛血清的培养基，常规培养24 h后，4%多聚甲醛固定细胞20 min，结晶紫染色着色25 min，取出小室，用棉签轻柔拭去小室内侧膜细胞，显微镜下随机选择5个视野进行细胞计数并拍照记录。

1.2.6.2细胞侵袭实验 提前以50 μL 10% Matrigel基质胶包被小室，余方法同上。

1.2.7Western-blot检测SFPQ表达敲低后BEL-7402细胞EMT相关蛋白表达量的变化 细胞转染72 h后，RIPA法提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白经变性后，取30 μg进行10% SDS-PAGE 蛋白电泳，常规转膜，5%脱脂牛奶封闭非特异性抗原，加入SFPQ(1∶500)，E-Cadherin(1∶1 000)，N-Cadherin(1∶1 000)，Vimentin(1∶1 000)，Snail(1∶1 000)和 GAPDH(1∶2 000)等抗体工作液，置于4 ℃冰箱孵育过夜。次日，PBST洗涤3遍，分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。PBST洗涤3遍后，ECL化学发光法显像并拍照记录。

1.3统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理。采用Student’st检验比较癌组织和癌旁组织SFPQ蛋白的染色评分；多组数据比较采用单因素方差分析，组间比较采用Dunnet-t检验；检验水准为P<0.05，采用双侧性检验。

2 结 果

2.1HCC组织 SFPQ蛋白的表达特点 SFPQ蛋白表达主要定位于肝细胞细胞核，表现为细胞核呈棕褐色染色(图1)。根据组织化学染色评分方法，癌组织评分(5.37±0.64)明显高于癌旁组织[(3.27±0.43)，P<0.01，图2]，说明SFPQ蛋白高表达于HCC组织。

SFPQ:脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子. A:评分12分；B:评分0分.图1 SFPQ蛋白在肝细胞癌组织中的表达特点( ×400)Fig 1 Expression of SFPQ protein in HCC tissues( ×400)

SFPQ:脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子.图2 30例肝细胞癌组织和癌旁组织SFPQ蛋白免疫组织化学染色评分Fig 2 IHC score of 30 paires of HCC tissues and adjacent tissues

2.2SFPQ的表达量和HCC患者预后的关系 OncoLnc数据库HCC数据集包含360名患者的总生存数据，在线生存分析表明，SFPQ表达水平与患者预后有显著相关性，SFPQ高表达组(Top33%，n=118)的生存期较低表达组(Bottom33%，n=118)显著缩短(图2，P<0.001)，提示SFPQ可能是HCC患者的预后不良因素。

SFPQ:脯氨酸、谷氨酰胺剪接因子.图3 SFPQ表达量和肝细胞癌患者总生存时间的关系Fig 3 Relationship between SFPQ expression and overall survival of HCC patiens

2.3SFPQ-siRNA对BEL-7402细胞中SFPQ表达水平的影响 荧光定量PCR结果显示，与Blank组比较，KD1和KD2组SFPQ mRNA表达水平均呈明显下调(图3A，P<0.05)，Western-blot 进一步证实SFPQ蛋白的表达水平也明显下调(图3B)，说明两对siRNA序列均有理想的基因敲低作用，SFPQ低表达细胞模型构建成功。

Blank:空白组； NC：阴性对照组； KD1：siRNA1组； KD2：siRNA2组. A:mRNA水平； B:蛋白水平. △：与Blank组比较，P<0.01.图4 siRNA对BEL-7402 细胞中SFPQ表达量的敲低效果Fig 4 Expression of SFPQ in BEL-7402 was knocked down by siRNA

2.4敲低SFPQ表达对BEL-7402细胞增殖能力的影响 生长曲线表明，KD1和KD2组细胞的生长速度均较Blank组明显减慢(P<0.05,图5)，提示敲低SFPQ表达抑制BEL-7402细胞的增殖能力。

2.5敲低SFPQ表达对BEL-7402细胞迁移和侵袭能力的影响 细胞迁移实验结果显示，KD1和KD2组穿膜细胞数均较Blank组显著减少(P<0.05)，其中KD1组穿膜细胞数为(110.6±10.9)，KD2组为(104.0±10.6)，NC组为(227.4±26.6)，Blank组为(239.2±45.2)；侵袭实

Blank:空白组； NC：阴性对照组； KD1：siRNA1组； KD2：siRNA2组. 与Blank组比较，△:P<0.01.图5 敲低SFPQ表达后BEL-7402细胞的生长曲线Fig 5 Growth curve of BEL-7402 cells after knockdown of SFPQ

验结果显示，KD1和KD2组与Blank组相比较，2组发生侵袭的细胞数也明显减少(P<0.05，图6)，其中KD1组细胞穿膜细胞数为(99.4±16.3)，KD2组为(86.6±9.1)，NC组为(235.2±20.0)，Blank组为(235.8±16.1)，说明敲低SFPQ表达可以同时抑制Bel-7402细胞的迁移和侵袭能力。

2.6敲低SFPQ表达对BEL-7402细胞EMT进程的影响 Western-blot 结果显示，KD1和KD2组上皮细胞标志物E-cadherin表达较Blank组明显升高，而间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin及抑制上皮特性的转录因子Snail的表达均较Blank组明显降低(图7)，表明敲低SFPQ表达可以逆转Bel-7402细胞的EMT进程。

Blank:空白组； NC：阴性对照组； KD1：siRNA1组； KD2：siRNA2组.图6 敲低SFPQ后BEL-7402细胞迁移和侵袭数量的变化Fig 6 Migrated and invaded BEL-7402 cells after knockdown of SFPQ

3 讨 论

本研究通过免疫组织化学染色法证实，SFPQ蛋白在HCC患者癌组织的表达显著高于其对应的癌旁组织。此外，利用Oncolnc数据库对不同SFPQ mRNA表达水平的患者进行生存分析，发现高表达SFPQ mRNA的患者术后总生存时间更短。体外细胞功能实验发现，敲低SFPQ表达后，肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭能力均显著下调，EMT进程受到阻滞，说明SFPQ在HCC中参与了肝癌细胞生长与转移的调控。

OncoLnc数据库包含了TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库的21种癌症、8 647例患者的生存资料和mRNA、miRNA测序数据及MiTranscriptome beta数据库的lncRNA测序数据。通过对基因的表达水平进行分组，可以直接得到不同基因表达水平的患者Kaplan-Meier生存分析结果[13]。数据库共有360名HCC患者的生存资料，按照推荐的设置进行生存分析，每组样本量仍达118例，因此所得的生存分析结果可靠性强，提示SFPQ可能是HCC患者的预后不良因素。

SFPQ众多的结构域赋予了它多种多样的功能，而目前关于SFPQ在肿瘤中表达及功能的研究还很有限。研究发现，SFPQ在前列腺癌中较癌旁组织低表达，且低表达SFPQ与前列腺癌进展显著相关，但预后分析结果显示，不同表达水平的患者术后无瘤生存时间和总生存时间均无显著差异[10]。在结直肠癌组织中，SFPQ的表达较非癌组织无显著改变[11]。而本研究结果显示，SFPQ蛋白在HCC组织中较非癌组织明显上调，并且高表达SFPQ的患者术后预后不良的可能性更高。这与在前列腺癌和结直肠癌中的研究结果截然不同，提示在HCC中，SFPQ可能通过其特有的分子机制影响着HCC的发生发展。

Blank:空白组； NC：阴性对照组； KD1：siRNA1组； KD2：siRNA2组.图7 敲低SFPQ表达后BEL-7402细胞EMT相关蛋白表达量的变化Fig 7 Expression of EMT related proteins in BEL-7402 cells after knockdown of SFPQ

SFPQ蛋白氨基酸序列中存在两个RNA结合结构域(RNA-binding domain, RBD)，SFPQ蛋白与RNA结合后，对PTBP2蛋白的调控作用可能受到影响[14-15]。Ji等在结直肠癌中发现，已在多种肿瘤中均被证实与肿瘤进展相关的长链非编码RNA MALAT1可与SFPQ相结合，导致癌基因PTBP2从SFPQ/PTBP2复合物中游离出来，从而促进结直肠癌的进展[11]。此外，还有研究发现，SFPQ可与长链非编码RNA GAPLINC结合，在一定程度上削弱GAPLINC对结直肠癌细胞侵袭的促进作用[16]。EMT是指上皮细胞失去其上皮表型，转变为具有较强迁移和侵袭能力的间质表型细胞的生物学过程[17-19]，是肿瘤发生转移复发的关键步骤。EMT在分子水平的重要标志性事件是相关转录因子(如snail1/2，ZEB1/2等)上调，上皮表型E-cadherin表达下调，间质表型N-cadherin和Vimentin表达上调[18]。本研究发现，利用siRNA敲低SFPQ的表达后，HCC细胞株的增殖、迁移侵袭能力均有所下降，EMT进程也受到阻滞，说明不同于结直肠癌，SFPQ在HCC中可能主要作为癌基因发挥作用，其中存在着未知的分子机制，有待进一步探究。

总之，本研究发现，SFPQ在HCC中呈高表达，并且高表达的SFPQ参与调控了HCC的增殖、迁移侵袭以及EMT进程，SFPQ有望成为肝癌患者预后的预测指标。但本研究也存在众多的不足之处，如在免疫组织化学染色阶段纳入的样本量不足，无法分析SFPQ蛋白的表达与患者临床病理参数间的关系；此外，SFPQ通过何种分子机制调控HCC的进展，也需要深入研究。

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