大鼠心肌损伤后S100A4的表达变化及其意义

李江涛，张国珺，严 鹏

大鼠心肌损伤后S100A4的表达变化及其意义

李江涛1，张国珺2，严 鹏3

目的 分析大鼠心肌损伤后S100A4的表达变化及其意义的研究。方法 选取清洁级雄性健康大鼠24只，体重(211.1±6.8)g。按随机数表法随机分为两组对照组与心肌损伤组，每组12只。通过注射异丙肾上腺素进行心肌损伤大鼠的造模，进行取血及心肌组织，采用光镜与电镜对大鼠心肌进行组织学观察；用蛋白免疫印迹法与免疫组织化学法检测心肌蛋白表达。结果 对照组大鼠血液中的一氧化痰(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)值均显著高于心肌损伤组大鼠，而心肌损伤组大鼠的乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)值均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。对照组大鼠表达平均光密度显著低于心肌损伤组大鼠表达平均光密度，差异具有统计学意义(P<0.05)；S100A4蛋白在心肌损伤组大鼠中的表达强，而在对照组大鼠中的表达弱。结论 大鼠心肌损伤后，S100A4蛋白在其心肌细胞中的表达变强。

心肌损伤；S100A4；异丙肾上腺素；心肌细胞

S100A4是一种多肽蛋，主要由101个氨基酸组成，属S100蛋白家族，S100家族中已确定的成员总共有 21个，也是钙离子结合蛋白家族中的最大亚家族之一[1-2]。有研究表明，S100A4 蛋白能促进肿瘤侵袭与转移，并能调节细胞的多种功能，当其与钙离子相结合，通过钙离子信号的转导途径在其细胞增殖、分化、基因表达、肌肉收缩、分泌和凋亡中发挥着重要的作用[3-4]。S100A4蛋白能促血管生成，推测S100A4蛋白对心血管系统损伤可能起到保护作用[5-7]。本研究对大鼠进行心肌损伤造模，分析大鼠心肌损伤后S100A4的表达变化及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 蛋白定量试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；S100A4抗体(美国Promega公司)；考马斯亮蓝试剂盒(上海索宝生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)(北京中生北控生物科技有限公司)；N，N-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺(湖北艾丹医药化工有限公司)、发光显迹液(美国santa公司) ；0.2 mm PVDF膜(美国Millipore公司)；十二烷基磺酸钠(成都银辉国际贸易有限公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(北京中山生物公司)；乳酸脱氢酶(LDH)；UV8500紫外-可见光分光光度计 (上海天美科学仪器有限公司)；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(美国进口)。

1.2 心肌损伤大鼠的造模 选取清洁级雄性健康大鼠24只，体重(211.1±6.8)g，购自昆明动物实验中心，所有大鼠进行适应性喂养1周，按随机数表法，随机分为两组，对照组12只，心肌损伤组12只。参考相关文献，心肌损伤大鼠造模方法：采用皮下注射异丙肾上腺素(ISO)法，剂量为850 μg/kg。对照组不进行注射，正常喂养。待造模成功后，采用乙醚麻醉大鼠，取血待测，并迅速取其心肌，浸泡于戊二醛电镜液中测定，剩余的采用液氮进行冷冻保存。

1.3 观察指标 ①血液生化指标测定及方法，LDH活性测定采用比色法；MDA采用硫代巴比妥酸法；SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法；NO含量测定采用硝酸还原酶法测定。②S100A4蛋白免疫组化检测，大鼠灌注固定30 min，取其心尖部的心肌组织，并迅速浸泡在含4%多聚甲醛的组织固定液中，1周后再进行常规组织脱水、透明、包埋以及石蜡切片等，其片厚5 μm。取适量心肌组织进行匀浆，提取总蛋白，并用考马斯蓝法对蛋白浓度进行测定。取100 μg 的蛋白进行上样，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜上，采用5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，与一抗作用1 h后再与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下作用 45 min，进行常规程序的显影。最后采用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

2 结 果

2.1 心肌损伤后大鼠血液中NO、LDH、SOD、MDA的变化 对照组大鼠血液中NO、SOD值均显著高于心肌损伤组大鼠，而心肌损伤组大鼠的LDH、MDA值均显著高于对照组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 大鼠血液中的NO、LDH、SOD、MDA的变化(±s)

2.2 大鼠心脏病理的电镜观察 对照大鼠心肌结构均基本正常，心肌纤维排列整齐，毛细血管通畅，结构清晰，且线粒体的结构致密，在心肌间质均未见明显的渗出。而心肌损伤组大鼠心肌组织间质渗出明显，毛细血管发生扩张，血管内皮细胞损伤明显，且有部分细胞凋亡，心肌纤维排列稀疏，线粒体发生轻度肿大，并呈单层的排列在心肌纤维两侧，有部分的线粒体嵴发生不同程度的断裂，偶见局灶性的坏死。详见图1。

2.3 S100A4在心肌中的表达 采用蛋白免疫印迹观察S100A4在心肌中的表达，其结果显示：对照组大鼠的S100A4的达较弱，而心肌损伤组大鼠心肌血管组织中S100A4表达较高。详见图2。

图2 蛋白免疫印迹观察S100A4在心肌中的表达

2.4 S100A4的蛋白免疫组化 两组大鼠免疫组化结果表明：对照组大鼠心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，S100A4的表达较弱或不表达；心肌损伤组大鼠心肌细胞及毛细血管细胞内均出现较多的棕黄色颗粒，S100A4表达较强。经图像分析显示，对照组大鼠表达平均光密度显著低于心肌损伤组大鼠表达平均光密度，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 S100A4的蛋白免疫组化(±s)

3 讨 论

S100A4 蛋白结构的特点与其生物功能多样性的相关十分密切。但对不同的S100 家族蛋白，通过对环绕的基本序列脯氨酸43进行分析，发现该区域对结构可塑性起着至关重要的作用[8-9]。异构化的脯氨酸是内在构象转换的过程，此过程对指导其配体的识别与调控蛋白的活性有潜在作用[10]。S100A4中至少有1个蛋白可能会在铰链区诱导特异的构象改变，且决定与靶分子之间的这种特殊蛋白-蛋白之间相互作用[11-12]。S100A4 蛋白与血管损伤、心肌损伤均具有一定的关系。其与血管再生及其胞外的基质重塑具有关联性，甚至可作为独立血管刺激因子发挥作用[13]。有研究发现，细胞内S100A4蛋白能刺激内皮细胞产生基质金属蛋白酶(MMP13)，促进细胞外基质重塑，而基质降解与重塑是血管生成的一项必要步骤[14-15]。经研究发现，植入到大鼠角膜中的移植物释放出的S100A4蛋白能够在一定程度上诱导新血管生成[16-17]。有学者揭示，S100A4蛋白和膜联蛋白Ⅱ(annexin Ⅱ)进行相互的作用，能促进组织的纤溶酶原激活物介导纤溶酶原激活，活化纤溶酶诱导血管生成[18-19]。

近年有学者新发现，S100A4蛋白有促血管生成的作用，其在心肌肥大的大鼠心脏中表达会表现为升高，并对胚胎干细胞具有一定促心肌生成作用，其提示着S100A4蛋白对心脏损伤可能具有保护作用[10-21]。通过免疫组化的定量分析显示，心肌肥大人的心脏中炎性细胞S100A4蛋白表达升高[22-23]。但损伤前的心肌细胞中S100A4蛋白完全不存在，而在急性缺血后的梗死区心肌细胞中显示存在S100A4蛋白被染色标定，但却无S100A4mRNA的表达[24-25]。有研究证实，S100A4蛋白参与心肌的纤维化过程，且在异丙肾上腺素诱导损伤心肌中出现表达升高的情况，这可能是由于S100A4 蛋白与心肌的肥大以及心肌损伤有关的初步证据[26-27]。对于S100A4的调控机制目前尚未解释清楚，这可能与干扰素、钙离子、S100A4基因的低甲基化及结缔组织的生长因子( connective tissue growth factor，CTGF) 等因素调控有关。但S100A4不仅受到钙离子的调控，且干扰素γ(IFN- γ) 能够在一定程度上抑制住S100A4的表达[28]。S100A4 蛋白与多种间质的细胞标志物共同存在于人与大鼠心脏中，使该项研究具有更为重要的临床意义。通过研究 S100A4蛋白的重组对培养的心肌细胞发生直接作用，观察S100A4 蛋白的重组体是通过依赖ERK1/2激活的状态信号途径，抑制住细胞的凋亡，对培养心肌细胞具有一定的促进生长与存活作用[29]。这提示着心肌损伤后 S100A4 蛋白可能是一个新表达上调的保护因子。Chen等[30]发现采用基因与药物的干预，结果表现出 CTGF 介导 S100A4 的上调大部分取决于ERK1/2激活状态，并且CTGF 与 S100A4表达的水平都与人的乳腺肿瘤相关密切。故推测 CTGF 可能在人乳腺肿瘤迁移与侵袭的过程中所发挥着关键的作用，主要是由于通过integrin-al-phavbeta3 -ERK1/2- S100A4 的通路激活实现。

本研究采用异丙肾上腺素对大鼠进行心肌损伤造模，对大鼠心肌损伤后S100A4的表达变化及其意义进行研究，结果发现，S100A4在心肌损伤组中的表达高于对照组，且对照组大鼠血液中的NO、SOD值均显著高于心肌损伤组大鼠，而心肌损伤组大鼠的LDH、MDA值均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，其原因是否也是S100A4通过该信号的途径抑制细胞凋亡，对异丙肾上腺素诱导的心肌损伤大鼠起一定的保护作用，其作用机制尚需进一步研究。

S100A4与多种疾病的产生有着密切的联系，不仅在胞内还能胞外发挥其生物学作用，这不但和组织的纤维化及肿瘤迁移等密切相关，还具有一定的促进某些组织和器官的再生能力。至今，对于S100A4 蛋白功能进行了一个比较全面的研究，但对于 S100A4 蛋白作用机制的研究还比较少，具体S100A4 蛋白在细胞的内外发挥着怎么作用以及其信号转导途径是什么? 其是否还存在着特异性的受体? 仍待进一步研究确定。相信随着分子生物学的技术不断发展，以及科研人员与学者对与S100A4 蛋白作用及其机制认识将会更加系统全面与深入，并为今后的心血管损伤防护新药的研发与上市奠定基础，并且能为心血管疾病诊断与治疗开辟新的思路。

[1] 于观贞，王杰军，陈颖，等.基因nm23和P53及S100A4在晚期胃癌中的表达及与侵袭转移的相关性研究[J].中华胃肠外科杂志，2006，9(2)：165-169.

[2] 鲁林源，艾开兴，黄新余，等.S100A4、VEGF的表达与胰腺癌预后的关系[J].肿瘤，2008，28(4)：326-329.

[3] 李明娜，范钦和.非小细胞肺癌中S100A2、S100A4及S100P表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2009，25(5)：503-507.

[4] McCormack PL.Sacubitril/Valsartan：a review in chronic heart failure with reduced ejection fraction[J].Drugs，2016，76(3)：387-396.

[5] Fama’F，Dattola V，Cicciu’M，et al.Natalizumab treatment for multiple sclerosis inducing a toxic acute myocardial damage[J].Is thereany Relationship，2016，206：127-128.

[6] 李毅力，李映良，梁平，等.100A4、SEPT7在儿童神经胶质瘤的表达特点及临床意义[J].第三军医大学学报，2015，16(11)：1673-1676.

[7] 韩志红，张秀珍，田小飞，等 卡铂耐药蛋白S100A4在上皮性卵巢癌中的表达及与化疗耐药的关系[J].现代肿瘤医学，2015，21(12)：3182-3185.

[8] Bakrania B，Du Toit EF，Wagner KH，et al.Pre- or post-ischemic bilirubin ditaurate treatment reduces oxidative tissue damage and improves cardiac function [J].Inter national Journal of Cardiology，2015，202：27-33.

[9] 曹睿杰.S100A4蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义[D].苏州：苏州大学，2014.

[10] 李毅力.儿童胶质瘤S100A4、SEPT7的表达特点及临床意义[D].重庆：重庆医科大学，2014.

[11] 刘保国.S100A4对乳腺癌新辅助化疗疗效评价的价值[D].泰安：泰山医学院，2014.

[12] Zhang K，Yu M，Hao F，et al.Knockdown of S100A4 blocks growth and metastasis of anaplastic thyroid cancer cells in vitro and in vivo，2016，17(3)：281-291.

[13] 曹颖，曹莉，高宇哲，等.同分子亚型乳腺浸润性导管癌中Integrin β4、S100A4的表达及意义[J].中国妇幼保健，2014，3(11)：438-442.

[14] 刘佳，符爽，史晓宇，等.iRNA干扰沉默S100A4基因表达对喉癌Hep2细胞周期和侵袭的影响[J].解剖科学进展，2014，3(23)：207-210.

[15] Ilyas EI，Nur BM，Laksono SP.et al.Effects of curcumin on parameters of myocardial oxidative stress and of mitochondrial glutathione turnover in reoxygenation after 60 minutes of hypoxia in isolated perfused working guinea pig hearts[J].Advances in Pharmacological Scienxes，2016，2016(2-4)：1-10.

[16] 戚晓琳，韩继召，董娴宁，等.100A4和P53蛋白在肥厚型心肌病心肌纤维化中的表达及意义[J].中国医药导报，2015，35(23)：44-47.

[17] Cheng LH，Hung KF，Huang TF.Attenuation of cancer-initiating cells stemness properties by abrogating S100A4 calcium binding ability in head and neck cancers[J].Oncotarget，2016，7(48)：216.

[18] 江青山，谭俞佳，邓珊.S100A4真核表达载体构建及对鼻咽癌细胞侵袭转移的影响[J].中国现代医学杂志，2016，4(33)：5-10.

[19] 岳温恒，厉娜，汪沁沁，等.100A4基因沉默抑制晚期糖基化终产物诱导内皮细胞钙化的作用[J].上海交通大学学报(医学版)，2016，7(3)：974-979.

[20] 张乾忠.心肌损伤生化标志物应用进展及检测结果解析[J].中国实用儿科杂志，2013，7(7)：481-487.

[21] 赵鹏飞，杨学军，张辰，等.低S100A4表达对胶质瘤细胞系SNB19侵袭和迁移的影响[J].中国神经精神疾病杂志，2014，12(9)：746-751.

[22] 谭俞佳.S100A4对CNE2细胞侵袭及EMT的影响[D].南华大学，2015.

[23] 许欣，辛晓燕，李佳，等.iRNA抑制S100A4表达对卵巢癌细胞CP70生物学特性的影响[J].现代生物医学进展，2014，13(22)：2401-2404.

[24] 柏干苹，李景怡，张荣华，等.100A4 siRNA对佐剂性关节炎大鼠炎症及细胞因子的影响[J].重庆医学，2014，31(9)：4162-4164；4168.

[25] 齐志勇，贾永峰，张治平，等.00A4、Bcl-2、Survivin在喉癌组织中的表达及临床意义[J].现代中西医结合杂志，2014，9(12)：929-932；969.

[26] 王竞，崔贵荣，霍晓辉，等.尿嘧啶化疗方案联合苦参注射液对晚期胃癌患者血清MMP-2、肿瘤标志物水平及S100A4水平影响研究[J].辽宁中医药大学学报，2016，2(11)：93-95.

[27] Doroudgar S，Quijada P，Konstandin M.S100A4 protects the myocardium against ischemic stress[J].Journal of Molecular & Cellnlar Cardiology，2016，6(100)：54-63.

[28] Ikemura S，Aramaki N，Fujii S.Changes in the tumor microenvironment during lymphatic metastasis of lung squamous cell carcinoma[J].Cancer Science，2016，20(10)：111.

[29] Chen D，Zheng Z，Xiao B，Li W.Orf Virus 002 Protein Targets Ovine Protein S100A4 and Inhibits NF-κB Signaling[J].Frontiers in Microbiology，2016，13(7)：1389.

(本文编辑王雅洁)

1.中国政法大学研究生院证据科学研究院(北京 100082)，

E-mail：liuzhiweits@163.com；2.太原市公安局晋源分局；3.西安交通大学 法医学院

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.015

1672-1349(2017)03-0313-04

2016-12-19)

引用信息：李江涛，张国珺，严鹏，等.大鼠心肌损伤后S100A4的表达变化及其意义[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(3)：313-316.