中药活性成分对oxLDL诱导血管平滑肌细胞泡沫化的影响

赵苗苗，王海芳，曹情雯，赵向绒，霍雪萍，孙晶莹，王光华，胡 军，刘勤社，3

中药活性成分对oxLDL诱导血管平滑肌细胞泡沫化的影响

赵苗苗1，王海芳1，曹情雯2，赵向绒1，霍雪萍1，孙晶莹1，王光华1，胡 军1，刘勤社1，3

目的 探讨中药活性成分黄芪甲苷(Astragaloside IV，ASIV)、羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)和芍药苷(paeoniflorin，PAE)对小鼠主动脉平滑肌细胞(ASMCs)泡沫化过程的影响，并探讨其可能的分子机制。方法 体外培养小鼠ASMCs，并利用免疫荧光染色对其进行鉴定。利用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和肿瘤坏死因α (TNFα) 诱导ASMCs泡沫化，并应用ASIV、HSYA和PAE进行干预，观察其对泡沫细胞形成的影响，应用油红O染色检测细胞形态学改变、酶促比色法测定细胞内胆固醇含量变化；应用RT-PCR和Western blot方法检测凝集素样氧化型低密度脂蛋白1 (LOX-1 )表达的变化。结果 oxLDL (80 μg/mL) 和TNFα (30 ng/mL)联用72 h可诱导ASMCs泡沫化，细胞内脂质颗粒明显增多，细胞内胆固醇含量增加，LOX-1表达上调；ASIV、HSYA和PAE显著抑制上述各过程。结论 ASIV、HSYA和PAE能够抑制ASMCs泡沫化，抑制oxLDL诱导的LOX-1表达可能是其作用机制之一。

主动脉平滑肌细胞；氧化型低密度脂蛋白；凝集素样氧化型低密度脂蛋白1 ；黄芪甲苷；羟基红花黄色素A；芍药苷；泡沫化过程；小鼠

动脉粥样硬化(AS)是冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的共同病理基础，而心脑血管疾病已成为威胁人类健康的主要杀手[1]。AS发生、发展的核心环节和主要的细胞学改变是氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)等脂类物质在内膜下不断蓄积所导致的泡沫细胞形成。有证据表明，45%的泡沫细胞是平滑肌细胞表型，只有30%是巨噬细胞表型[2]。活血胶囊主要由黄芪、红花和赤芍等12味中药组成，临床治疗冠心病疗效确切，能有效改善气虚血瘀证，改善血脂和血液流变学变化。动物实验表明其可减少AS 斑块内巨噬细胞浸润，降低斑块内 TNFα 表达及血清 IL-6 的水平[3]。黄芪甲苷(ASIV)、羟基红花黄色素(HSYA)和芍药苷(PAE)分别是黄芪、红花、赤芍中含量最高的有效活性成分，前期研究表明，这些物质能够抑制体外细胞中肿瘤坏因子α(TNFα)激活的信号通路，发挥抗炎作用[4]。本研究通过体外培养主动脉平滑肌细胞(ASMCs)并诱导其泡沫化，观察ASIV，HSYA和PAE对平滑肌泡沫细胞形成的直接影响，初步探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 小鼠ASMCs购自上海诺晨生物技术有限公司。

1.1.2 试剂与药物 TNFα购自美国Calbiochem公司；氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和油红O购自上海鲁汶公司；胆固醇测定试剂盒购自北京普利莱基因公司；RNA提取试剂盒购自TIANGEN BIOTECH；反转录及RT-PCR试剂盒购自TaKaRa；实验所用一抗LOX-1、β-actin、-smooth muscle Actin(-SMA)购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ASMCs采用含有10% 胎牛血清的高糖DMEM培养液，37℃、5% CO2条件下培养。

1.2.2 免疫荧光染色鉴定 细胞接种在盖片上，4%多聚甲醛固定；0.2% Triton X-100透化，5% BSA室温封闭30 min，用1%BSA1∶50稀释-抗孵育过夜，荧光二抗(1∶100)避光孵育30 min，荧光显微镜观察拍照。

1.2.3 油红O染色 细胞培养于6孔板内，经处理后用PBS润洗，4 %多聚甲醛固定15 min，油红O染色液染色30 min，苏木素复染。倒置显微镜下观察并拍照，随机选取5个区域进行拍照。

1.2.4 细胞内总胆固醇含量测定 培养细胞用PBS洗涤去除残存培养液，按比例每1×106个细胞加入100 μL 裂解液，混匀，静置10 min；取180 μL测定工作溶液加入微板，加入30 μL空白对照溶液、标准品或待测样品；37℃ 反应30 min；绘制标准曲线并计算总胆固醇浓度。

1.2.5 Western blot法检测凝集素样氧化型低密度脂蛋白(LOX-1)蛋白表达 收集细胞裂解样品，氨基黑法定量，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转NC膜，5% 脱脂牛奶室温封闭30 min，4℃一抗孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL法发光。

1.2.6 实时定量荧光RT-PCR 收集细胞，按说明书提取总RNA。以总RNA为模板反转录出cDNA链；采用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒以cDNA为模板进行PCR反应。引物：β-actin：正向引物 5′-TAGGCGGACTGTTACTGAGC-3′，反向引物5′-TGCTCCAACCAACTGCTGTC-3′； LOX-1正向引物5′- CCCTCCAAAGTCTCCCAACC-3′；反向引物5′-GCCTGCACTTGAGGAGGATT-3′。反应条件：95℃ 变性20 s，58℃ 退火30 s，72℃ 延伸45 s，设40个循环。以β-actin为内参基因，评价目的基因表达水平。

2 结 果

2.1 ASMCs鉴定(见图1) 以抗-SMA抗体进行免疫荧光染色，结果如图1a 所示，激光共聚焦显微镜下ASMCs呈现绿色荧光，阴性对照组(图b，未加抗-SMA一抗)则未见荧光信号。

注：a为ASMCs b为阴性对照组

2.2 油红O染色(见图2) 对照组细胞内基本无红色脂质颗粒，oxLDL诱导组及oxLDL+TNFα诱导组细胞内红色脂质颗粒明显增多，且oxLDL+TNFα诱导组更为显著。与oxLDL+TNFα诱导组相比，TNFα+oxLDL+ASIV组，TNFα+oxLDL+HSYA组及TNFα+oxLDL+PAE组细胞内红色脂质颗粒都有不同程度的减少。

注：a为CN；b为oxLDL；c为oxLDL+TNFα；d为TNFα+oxLDL+ASIV；e为TNFα+oxLDL+HSYA；f为TNFα+oxLDL+PAE

2.3 细胞内总胆固醇含量(见图3) oxLDL诱导组及TNFα+oxLDL诱导组细胞内总胆固醇含量较对照组显著升高，且TNFα+oxLDL诱导组升高更为显著。与TNFα+oxLDL诱导组相比，ASIV，HSYA和PAE均可以降低细胞内总胆固醇含量(P<0.05)。

2.4 药物对oxLDL诱导LOX-1基因表达的影响(见图4) 如图4a所示，oxLDL可诱导LOX-1 mRNA表达上调，其作用在6 h时最为明显，因此我们选取6 h 为oxLDL作用时间。如图4b所示，ASIV、HSYA和PAE(浓度100 μM)均能够显著抑制LOX-1 mRNA的表达。

图3 药物对细胞内总胆固醇含量的影响

注：图α为oxLDL诱导LOL-1mRNA表达的时效关系(*P<0.05 vs CN；**P<0.05 vs CN)。

2.5 药物对oxLDL诱导LOX-1蛋白表达的影响 图5a所示，oxLDL可诱导LOX-1 蛋白表达上调，其作用在6 h～8 h时较明显，选取6 h 为oxLDL作用时间。如图5b所示，ASIV、HSYA和PAE(浓度100 μM)均能够显著抑制LOX-1 mRNA的表达。详见图5。

注：图a为oxLDL诱导LOX-1蛋白表达的时效关系；图b为药物对oxLDL诱导的LOX-1蛋白表达影响

3 讨 论

AS是脂类物质在血管内膜下不断蓄积所致的血管炎症性反应[5]，而泡沫细胞形成在AS的发生发展中扮演十分重要的作用，泡沫细胞形成有两个主要生物学特征，包括细胞形态学改变，细胞圆形，体积较大，细胞质内脂类物质增多，或可形成脂滴；细胞内胆固醇含量增多[6-7]。这与油红O染色及细胞内总胆固醇含量测定的结果相一致。

黄芪是中药临床常用中药之一，首载于《神农本草经》，具有“补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌”等功效，古之医家认为“补脾胃之气及胸中宗气乃黄芪所长”[8]，ASIV是黄芪中的主要活性成分，目前主要以其评判黄芪药材的优劣[9]，现代药理研究证实ASIV对心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、肾脏、肺、脑、肝脏都具有一定的保护作用；红花是传统的活血化瘀类中药，具有活血通经，化瘀止痛的功效。《本草纲目》记载其具有：“活血、润燥、止痛、散肿、通经”的功效， HSYA作为中国药典2010版规定的红花最具代表性活性成分，是目前临床用药中为数不多的中药注射剂之一[10]，发展前景可观。现代药理研究证实其具有降胆固醇、降血压、保护心肌细胞、抗脑血栓形成等作用；赤芍为毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，具有清热凉血、散瘀镇痛之功效。唐宋之后渐有白芍、赤芍之分，《本草纲目》曰：“白补而收，赤散而泻”。许文平等[11]研究发现芍药苷可显著抑制ApoE基因敲除小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，降低主动脉各段斑块面积/主动脉血管管腔面积比值，表明芍药苷具有明显的降脂及抑制动脉斑块形成的作用。Li等[12]发现芍药苷可以通过上调ABCA1及下调CD36的表达抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成。本研究证明：ASIV、HSYA和PAE 能够在体外实验中通过降低细胞内胆固醇含量而抑制ASMCs泡沫化进而发挥抗AS作用。

LOX-1是近年来新发现的一类清道夫受体，在血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、泡沫细胞等均有表达，介导并参与oxLDL内吞和细胞内信号激活，促进AS的发生发展[13]。血管平滑肌细胞泡沫化与LOX-1的表达密切相关，ox-LDL可诱导血管平滑肌细胞的LOX-1表达上调，且高浓度oxLDL的诱导作用更强，提示LOX-1是结合或内吞oxLDL的重要受体[14]。本研究也证实：泡沫细胞形成后LOX-1基因及蛋白的表达均上调，且ASIV、HSYA和PAE可显著抑制LOX-1基因及蛋白的表达。说明活血胶囊有效活性成分ASIV、HSYA和PAE抑制ASMCs泡沫化可能与LOX-1表达下调，脂类物质摄取减少相关。

但影响LOX-1表达的具体途径尚不确定，oxLDL诱导的ASMCs泡沫化可能还与负责胆固醇运输(ABCA1)及酯化(ACAT1)的基因相关，泡沫细胞形成时， ABCA1表达升高，而ACAT1表达下降，后期实验中，将继续深入研究活血胶囊活性成分ASIV， HSYA和PAE抗血管平滑肌细胞泡沫化的机制，为中药抗AS提供理论基础。

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(本文编辑王雅洁)

国家自然科学基金常规面上项目(No.81573823)；陕西省自然科学基金资助项目(No.2015 JM 8460)

1.西安交通大学医学院第三附属医院陕西省人民医院(西安 710061)；2.陕西省中医医院；3.陕西中医药大学

刘勤社，E-mail：lqsspph@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.014

1672-1349(2017)03-0310-04

2016-08-08)

引用信息：赵苗苗，王海芳，曹情雯，等.中药活性成分对oxLDL诱导血管平滑肌细胞泡沫化的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(3)：310-313.