现代电子技术在阿尔茨海默病检测中的应用

温 涵(综述)，温立斌(审校)

(1.合肥工业大学信息工程系微电子科学与工程专业2014级1班，安徽 宣城 242000；2.江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室，江苏 南京 210014)

·综 述·

现代电子技术在阿尔茨海默病检测中的应用

温 涵1(综述)，温立斌2*(审校)

(1.合肥工业大学信息工程系微电子科学与工程专业2014级1班，安徽 宣城 242000；2.江苏省农业科学院兽医研究所人兽共患病防控研究室，江苏 南京 210014)

阿尔茨海默病;淀粉样β肽类;现代电子技术；综述文献

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是为了纪念德国医生阿洛依斯·阿尔茨海默(Alois Alzheimer)而命名的，它是人类的一种不可逆、退行性脑病，患者出现严重的记忆障碍、认知功能障碍、行为和心理症状，如抑郁、应激、焦虑和情绪障碍[1]。另外，AD患者容易并发感染其他致命性疾病，如人类免疫缺陷病毒感染(艾滋病病毒)、癌症、帕金森等。世界卫生组织将AD作为一个超过6 000亿美元花费的全球范围的社会经济问题。世界卫生组织确认3 700万人患痴呆症，其中1 700万人为AD患者。最近研究表明，在2050年前，老龄化人口的AD发病率将稳定增长至目前的3倍以上[2]。目前的科学技术和水平尚不能治愈AD，因此连续检测AD进展成为患者选择治疗和管理疾病的关键。目前，尚不清楚AD的具体发病机制，存在许多假说，如基因突变、氧化应激、炎症、病毒感染等[3]。当今普遍接受的是淀粉样级联假说。临床研究表明，AD患者脑和创伤性脑损伤表现出淀粉样肽积累的相似性，主要是β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)和Tau蛋白。患者的脑脊液检测Aβ和Tau蛋白有望成为生物标志物[4]。Aβ是AD发病过程中的核心病理，其在脑内的聚集引发系列分子级联作用，造成炎症损伤，对神经元和突触产生毒性作用，引起AD发生发展。本综述集中于使用现代电子技术检测Aβ，作为AD的检测方法。

1 AD的Aβ假说

Aβ有多种形式，如单体、寡聚物、原纤维和纤维[5]。在AD进展中发挥着不同重要的生理或病理影响。单体的Aβ没有神经毒性，而形成的寡聚物和纤维Aβ通过成核依赖性复合物加工表现出神经毒性，阻止长时程增强影响突触可塑性。一般来说，由于磷酸化Tau蛋白、Aβ斑块和不溶性、疏水性Aβ的聚集造成神经纤维缠结而引起了AD[6]。跨膜淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的降解导致Aβ斑块的形成，APP降解的产生有淀粉样和非淀粉样途径2种机制[1]。淀粉样机制是通过β-分泌酶即β位点APP裂解酶和γ-分泌酶来裂解APP产生Aβ，形成毒性寡聚物，聚集形成斑块；非淀粉样途径是通过α-分泌酶即位于Aβ序列中去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白10来裂解APP，阻止Aβ形成，防止可溶性分泌淀粉样前体蛋白α片段的释放。这些改变影响了大脑神经营养和神经保护的特性。

Aβ斑块形成与AD发生和发展相关。不同氨基酸链长的2个主要亚型，即Aβ1-40和Aβ1-42是神经性斑块形成的主要成分，在自发自缔合成超分子组装体形成纤维和斑块过程中，这2个淀粉肽显示了不同的速度[7]。大脑中Aβ1-40的含量比Aβ1-42的要高。与Aβ1-42相关的斑块形成显示了更快的聚集，造成更多的自由基损伤而导致神经毒性。通过影响前炎细胞因子分泌、可溶性神经毒性寡聚物形成和纤维聚集，Aβ聚集改变了大脑的免疫应答，出现痴呆。Aβ寡聚物与神经细胞脂质双层结合，影响细胞膜的稳态、钙离子的上调、细胞膜去极化、活性氧的增强，导致神经递质的兴奋毒性和神经细胞死亡[8]。

2 神经影像学方法检测Aβ

诊断AD的传统方法是对患者大脑进行尸体检查，确定老年斑和神经原纤维缠结[9]。AD的诊断基于临床病史和活体脑成像，如使用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、单光子发射型计算机断层扫描显像(single-photon emission computed tomography,SPECT)、正电子发射断层显像(positron emission tomography，PET)、近红外(near infrared，NIR)响应成像和表面等离子体共振成像(surface plasmon resonance imaging,SPRi)。神经心理学、认知和神经学测试也用来分析AD。神经影像学是临床上评估AD的传统和可靠技术，诸如PET、MRI、NIR等技术是广泛采用的检测AD脑异常的方法。目前在设计和发展成像以及具有穿透血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)能力的荧光剂方面作了巨大努力。不幸的是，这些方法费时，昂贵，准确度有限(大约85%)，近来可溶性标志物(如脑脊液或血浆中Aβ或Tau蛋白水平)被开发用来监测疾病[10]。Wadghiri等[11]将转基因小鼠作为AD监测的动物模型，由于过表达突变APP和早老素蛋白1，这种转基因小鼠出现类似AD患者的Aβ斑块，磁标记的Aβ1-40肽，与Aβ有较高亲和力，用于MRI检测小鼠脑中的Aβ斑块。磁标记的Aβ1-40粒子通过动脉给药能够穿过血脑屏障与Aβ斑块的结合，应用免疫组织化学MRI扫描定量评价Aβ斑块。Raymond等[12]应用了成像荧光剂的超声辅助给药和通过BBB的抗Aβ抗体来检测AD，通过静脉给药(台盼蓝和抗体)于2种不同转基因AD小鼠品系，使用MRI指导AD监测和治疗，结果在海马中显示了(16.56+5.4)倍增量的台盼蓝荧光强度和(2.76+1.2)倍增量位于淀粉样斑块的抗Aβ抗体。

基于神经影像学探针的NIR荧光用于临床前AD的监测和治疗。Fu等[13]探索了基于不同电子给体-受体末端基团的各种给体-受体NIR探针，能够通过π-共轭系统互作检测AD患者脑中的Aβ沉积。合成的2个不同链长和具有优良荧光性能(发射极大值>650 nm和高量子产率)的探针，能够通过BBB，也能从脑中洗掉。对于Aβ聚集物，这些探针显示了高敏感性和高亲和力。基于MRI的体内NIR成像显示优化的NIR探针能区分小鼠模型，可用作Aβ聚集物或斑块检测的潜在的神经影像学探针。最近，NIR神经影像学探针用于监测AD治疗期间的Aβ变化，基于姜黄素的NIR荧光PET成像探针用于检测可溶性和不溶性的Aβ。Zhang等[14]使用 (T-4)-[(1E,6E)-1,7-Bis[4-(dimethylamino)phenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dionato-kO3,kO5]difluoroboron(CRANAD)-3探针检测了转基因AD (APP/PS1)小鼠模型的Aβ 2种类型，与同日龄野生型小鼠相比，结果显示2.29倍的信号。这种方法成功用于检测早期阶段的AD。Jaruszewski等[15]设计了一种亲水性纳米载体，靶向脑血管淀粉样蛋白，用于AD的早期诊断。这种纳米载体包括钆,基于MRI或SPECT成像造影剂(如碘125)和抗炎或抗淀粉剂(如姜黄素)或免疫抑制剂(如地塞米松)来靶向和处理脑血管淀粉样蛋白。抗Aβ抗体固定在纳米载体上。MRI和SPECT成像结果证实纳米载体能够作为有效的诊断试剂以及减少脑血管淀粉样蛋白相关炎症。

Gagni等[16]依据免疫学方法建立了一种检测Aβ1-42新的标记/非标记硅/二氧化硅芯片技术，该技术平台建立在干涉反射成像检测基础上，显示出高通量和高敏感性。使用三元共聚物包被硅/二氧化硅，应用干涉反射成像传感器检测与Aβ1-42结合的抗Aβ抗体特异性识别位点。这种方法检测脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)样品的下限可达73 pg/mL。Kaminski Schierle等[17]报道了Aβ装配可作为荧光蛋白的能量受体，基于荧光共振能量转移传感器监测Aβ聚集动态。

抗体与纳米技术相结合的平台包括磁性核壳纳米粒子、附着混合氧化石墨烯、建立非标记表面增强拉曼光谱，从CSF中选择性分离Aβ。由于强等离子体耦合，纳米颗粒使强拉曼光谱指纹显示出高敏感性，经磁性分离可检测Aβ和Tau蛋白至100 fg/mL。此类型传感器可分别检测Aβ和Tau蛋白至0.312 ng/mL和0.15 ng/mL，结果优于酶联免疫吸附测定[18]。载脂蛋白E4(apolipoprotein E，ApoE4)促进了Aβ聚集，也是AD进展的主要风险因子。在生理状态下使用局域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)检测ApoE4的传感器已开发，ApoE4仅与Aβ1-42结合，特异性自组装结合纳米金表面，使用LSPR监测电荷差异，这种传感器检测Aβ1-42达1.5 pmol/L，引起LSPR峰位移动2.9 nm。这种实时检测方法可用来探索ApoE4-Aβ互作，以非标记方法优化治疗靶向[19]。

Cheng等[20]报道多数AD患者蛋白错误折叠与富含β折叠的淀粉样纤维聚集有关。Aβ肽可与诸如锌、铜和铁等金属离子互作，导致活性氧产生。基于核依赖性Aβ聚集或增殖纤维形成的互作过程可用SPR成像检测。为此，开发出一种单芯片用来同时监测多调节物对纤维延伸的影响，使用SPRi获得的结果经透射电子显微镜和硫黄素T验证，确证了SPRi实验中不同程度Aβ聚集与纤维不同延伸率相关。通过抗原替代物ADP3类肽(一种合成的N取代寡甘氨酸)，Zhao等[21]使用SPRi检测Aβ鉴别和分离体液中的靶抗体，用制备的金镀膜玻璃芯片执行SPRi，测定AD患者体内的ADP3浓度(30～48 mmol/L)，芯片上捕获的ADP3通过抗Aβ1-42和人IgG抗体来确认，结果观察到与抗Aβ有关的信号要比抗IgG的要高，确证了ADP3对人血清中Aβ1-42的选择性。根据这些发现，作者报道AD患者的血清具有低IgG和高Aβ1-42特征。Lee等[22]制备了博导耦合双金属-SPR芯片来检测Aβ水平。由于狭窄的半最大值全宽度，这种改良的SPR系统显示出比金基系统更好的特性，抗Aβ抗体固化在博导耦合双金属-SPR芯片上，检测Aβ水平范围为100～2 000 pg/mL。

3 电化学传感技术检测Aβ

由于具备快速、特异和敏感等突出特点，电化学免疫传感技术可以在pg/mL水平上检测靶标。此外，微纳电极、纳米传感材料、微电子和微型感应传感器的出现又提高了技术性能。Veloso等[8]应用基于丝网印刷碳糊电极和方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)的非标记电化学生物传感器来检测β-折叠阻断五肽(亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，LPFFD,FibIII)，它是一种Aβ纤维和寡聚物的抑制物。作者应用SWV检测早期聚集阶段Aβ1-42与FibIII的互作。通过监测其单一酪氨酸残基的氧化来测定SWV信号。使用硫黄素T染料作为Aβ的显像剂，通过荧光成像来验证结果。Zhang等[23]将电化学和高效液相色谱法相结合，通过检测连接小肽(赖氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸，KLVFFAE)N端的Fc氧化，抑制Aβ1-42聚集而进行Aβ的检测。使用姜黄素作为电活性成分来抑制Aβ聚集，高效液相色谱法-电化学技术使可溶性Fc-KLVFFAE分子从姜黄素中分离，实时控制聚集。

诸如SWV、微分脉冲伏安法和循环伏安法(cycle voltammetry, CV)等电化学技术，利用玻碳电极快速和非标记检测Aβ1-40和Aβ1-42也有报道。使用酪氨酸作为氧化还原基团，监测氧化信号来检测Aβ水平。Aβ的聚集改变了结构构象，导致酪氨酸氧化信号的改变。基于传感性能，作者认为微分脉冲伏安法优于CV和SWV，其检测限达0.7 ng/mL，对于Aβ1-40和Aβ1-42的变异系数分别为0.3%～1.4%和0.4%～3.0%[24]。Li等[25]开发了一种基于肽的SWV电化学传感器来检测Aβ1-42可溶性寡聚物，基于肽生物传感器的表面电子转移动力学区分了Aβ是否存在。结果显示其检测限达240 pmol/L。

金属(铁、铜和锌离子)介导的Aβ聚集增加了活性氧簇产生，从而对脑细胞造成更大损伤。用苏氨酸作为信号，开发的SWV生物传感器用来了解在有金属或没有金属情况下Aβ聚集的动力学，结果显示锌和铁金属离子增加了Aβ聚集。该传感器对Aβ响应，可分析金属螯合富含组氨酸区域(即肽疏水部分)的效果。这些结果提出了添加金属螯合剂时Aβ聚集的机制[26]。

Yu等[27]制备了敏感的电化学纳米探针，使用生物共轭的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-Au纳米粒子(nanoparticles，NPS)-凝溶胶蛋白检测可溶性Aβ1-40/1-42肽。该研究小组探索了凝溶胶蛋白和Aβ之间的特异性结合，作为一种替代方法来检测Aβ。通过特异性结合，用凝溶胶蛋白捕获可溶性Aβ，通过测量标记AuNPS上的HRP氧化/还原进行电化学信号的检测。传感器对Aβ1-40/1-42的检测限为28 pmol/L。血红素Aβ1-16是一种电活性剂，具有电催化O2还原功能，Liu等[28]用其修饰AuNPS来检测Aβ，将能与Aβ N端特异性结合的单克隆抗体固化在AuNPS-血红素/Aβ1-16上，由于Aβ被单克隆抗体捕获导致伏安响应下降，阻止了AuNPS-血红素/Aβ1-16对传感器表面的吸附，该传感器对Aβ的检测范围为0.02～1.50 nmol/L，检测限为10 pmol/L。

Liu等[29]制备了一种不使用抗体的电化学传感器，将碱性磷酸盐-半胱氨酸-Prp(95-115)肽固化在金电极上，使用CV技术特异性检测Aβ寡聚物。基于二茂铁的电化学氧化还原循环的外层到内层机制用来放大信号，达到更好的灵敏度。该传感器的检测限为3 pmol/L，优于传统的类三明治检测过程。Xia等[30]建立了非标记、无酶的生物传感器，通过CV监测β 位淀粉样前体蛋白裂解酶 1(beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)，一种天冬氨酸蛋白酶，可促进Aβ的产生，该传感器也可检测BACE1的抑制剂。在传感过程中，Aβ-血红素复合物在传感器表面上形成，显示O2分子的电催化还原。由于抑制剂即IC-50的影响，BACE1的抑制产生了较高的电化学信号。这种方法简便、成本低，但检出限相对较高。

Rama等[31]将AuNPS修饰丝网印刷碳电极(screen-printed carbon electrodes,SPCE)，应用竞争免疫技术检测Aβ1-42。固化生物素Aβ1-42于电极表面，在那里Aβ与抗Aβ1-42抗体竞争。该传感器对Aβ的检测范围为0.5～500 ng/mL，检测限为0.1 ng/mL。作者认为这种免疫传感器简便，可与传感设备集成，有望用于便携式传感系统。Liu等[32]开发了一种敏感和特异的电化学生物传感器，固化抗Aβ抗体于金电极上，检测样品中Aβ1-42和总Aβ。使用链霉亲和素耦合的碱性磷酸酶和生物素化Aβ来捕获抗体修饰的电极。随着与Aβ锚定抗体竞争的Aβ水平增加，获得的电化学信号减少。该传感器对CSF样品中Aβ1-42和总Aβ的检测限为5 pmol/L。一种基于碳纳米管(carbon nanotube，CNT)薄膜的生物传感器包含金属半导体场效应晶体管结构(metal-semiconductor field-effect transistor，MESFET)，其中金作为一种栅材料，将抗HRP抗体连同蛋白G或自显示蛋白A Z结构域固化在金上，CNT-MESFET生物传感器比CNT-FET敏感，该传感器对血液样品Aβ的检测范围为1 pg/mL～1 ng/mL，检测限为1 pg/mL[33]。

电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)也用于检测Aβ来评估AD。EIS方法是最好的无创分析工具，可用于监测蛋白互作、生物传感、纳米毒性和肿瘤药物相互作用等生物学现象。使用10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原电位探针，在0.30 V电位下检测Aβ，该系统通过一种多酚类化合物，即白藜芦醇与Aβ互作，通过监测电荷转移电阻的变化来研究Aβ的聚集和抑制[34]。

一种非标记的EIS传感器采用生物素标记的细胞朊蛋白(PrPC残基95-110)，用来特异性检测Aβ寡聚物。PrpPc(95-110)是一种突触蛋白，介导神经元结合和Aβ寡聚物毒性。基于生物素/抗生物素与聚合物功能化金-SPE桥，采用逐层方法，将这种蛋白用来制备Aβ阻抗生物传感器。该传感器对Aβ的检测限为0.5 pmol/L。然而这种高灵敏传感器尚需对重复性和稳定性优化以便用于临床[35]。

将金盘与二硫代二丙酸SAM功能化，固定特异抗体(OC和A11)，这种EIS传感器用来检测Aβ1-42寡聚物和纤维状态的聚集。以此开发的技术平台可检测抑制Aβ聚集的均三嗪衍生聚合调节剂(TAE-1和TAE-2)性能[36]。

通过特异的Aβ抗体固定到纳米金颗粒，溅射到阳极氧化铝纳米半球阵列检测Aβ1-42。该传感器对血液Aβ的检测范围为1～10 pg/mL，检测限为1 pg/mL。线性方程为电荷转移电阻=29 098×log[Aβ1-42] +90 150，回归系数为0.991 6[37]。Lien等[38]基于一次性电化学印刷碳阵列制备了非标记的EIS Aβ生物传感器，通过优化表面化学物质(蛋白G)制备的基于SAM-AuNPS的Aβ生物传感器有更高的敏感性。该传感器对Aβ的检测范围为2.65 nmol/L～2.04 μmol/L，检测限为0.57 nmol/L。最近基于SPR和EIS的多参数非标记分析系统用来监测感染Aβ1-42的犬肾上皮细胞变化，通过添加非致命剂量的Aβ到传感器表面，引起细胞基质黏附和细胞-细胞紧密连接或细胞骨架重构的变化，基于SPR和EIS的方法能够监测产生的双相细胞反应，可用来研究细胞层上Aβ纤维的动态变化[39]。

4 展 望

AD给患者家庭带来巨大的经济、心理、神经等负担，对社会发展进步、福利和安全等也带来巨大挑战。尽管上述的MRI、PET、SPET、NIR、SPR和 SPRi等神经影像学方法都能检测生物体液中的Aβ来监测AD进程和发病机制，然而由于它们需要复杂设备和高技术人员操作，所以这些方法仅限于诊所使用。为了克服这些缺点，电化学传感方法被用来快速、特异和灵敏检测Aβ，虽然目前仅限于研究使用，但今后如果与纳米技术集成，使设备微型化，有望应用于AD的即时检验。

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(本文编辑：赵丽洁)

2016-11-17；

2016-12-14

国家自然科学基金资助项目(31272574，30972184)

温涵(1995-)，男，河北石家庄人，合肥工业大学学生，从事微电子研究。

*通讯作者。E-mail:wlbwhxjp@163.com

R745.7

A

1007-3205(2017)01-0102-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.025