多酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的研究

樊 柳，黄文书，张永忠

（1.新疆农业大学食品科学与药学院，新疆乌鲁木齐 830091；2.新疆九鼎农业集团有限公司，新疆乌鲁木齐 830009）

多酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的研究

樊 柳1，2，*黄文书1，张永忠2

（1.新疆农业大学食品科学与药学院，新疆乌鲁木齐 830091；2.新疆九鼎农业集团有限公司，新疆乌鲁木齐 830009）

以葡萄酒厂中的废料——葡萄皮渣为主要原料，采用多酶法活化其中的膳食纤维，达到增加葡萄皮渣中可溶性膳食纤维含量的目的。经过单因素试验和正交试验，发现酶活化葡萄皮渣可溶性膳食纤维的最佳反应条件为蛋白酶添加量0.3%，糖化酶和纤维素酶（混合酶）的最佳配比1∶4，混合酶添加量1.2%，混合酶酶解温度60℃，混合酶酶解时间120 min。

葡萄皮渣；可溶性膳食纤维；提取

新疆地处葡萄种植的黄金区域（北纬30°～50°），在葡萄的生长季节，白天日照时间很长，有利于葡萄进行充分的光合作用；夜晚与白天的温差较大，年均日温差为14～16℃，非常利于葡萄品质和产量的提高，这些都不难看出，新疆的气候条件十分适宜葡萄种植。2014年新疆葡萄种植面积达14.91×104hm2，总产量为213.6×104t（包括兵团在内）。而新疆葡萄酒的产区主要集中在鄯善、玛纳斯和石河子等地区。迄今为止，新疆葡萄酒的加工企业大约有20家，加工能力可以达到20×104t左右，大约占到全国葡萄酒总产量的34%[1]。

在葡萄酒的酿制过程中，经过榨汁处理或发酵后的葡萄皮渣，大约占原果总质量的10%，这些皮渣主要以葡萄皮、籽、枝条为主。

目前，葡萄皮渣常见处理办法是把其当做肥料或者饲料处理，这样不仅造成了资源浪费，还污染了环境，而且资源的利用率也极低。因此合理开发利用葡萄皮渣，不仅可以提高产业的附加值，使其经济有效地利用资源，提高葡萄的综合利用价值，还对促进葡萄产业的可持续发展具有重要的发展意义[2-7]。

膳食纤维（Dietary fibre，DF）指植物性食物中含有不能被人体消化吸收的碳水化合物，被营养家列于继碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、水传统六大营养素之后的“第七营养素”，是平衡膳食结构的必需营养素之一[8-9]。

膳食纤维不仅可以吸附胆固醇和其他有机化合物，而且可与铅及其他有害离子交换，减少这些物质的吸收率，从而促使人体内的有毒物质、化学药品等排出体外，可见膳食纤维具有降糖减肥、降脂和排毒等作用。因此，营养专家认为，膳食纤维食品将是在21世纪的主要食品之一[10-18]。

目前，我国对葡萄皮渣中提取膳食纤维的研究还处于起步阶段，尤其对于膳食纤维的提取、检测方法等方面的研究相对较少，现在一般使用的方法是碱法或者发酵法。但是，传统的碱制备法受多种反应条件影响，导致成本较高，而且在实际生产操作过程中难度较大，不宜推广使用，并且所使用的大量酸碱试剂在环保方面存在弊端。为此，试验以葡萄皮渣为原料，利用多酶法对葡萄皮渣中膳食纤维进行提取研究，以期为葡萄皮渣提取膳食纤维的工艺和应用提供一定技术支持[19-25]。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

试验用葡萄皮渣，新疆张裕葡萄酒业提供。

1.1.2 试剂

糖化酶（活性10万/g）、纤维素酶（活性1∶1 000）、蛋白酶（活性6万/g），北京奥博星生物有限责任公司提供；95%乙醇、浓盐酸，均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

6202号小型粉碎机，北京兴时利和设备有限公司产品；HH.S11-6型电热恒温水浴锅，北京永光明机电设备有限公司产品；ML204型分析天平，梅特勒-托利多产品；R-1005型旋转蒸发仪，郑州长城仪器设备有限公司产品；TD5A-WS型台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；LYJB300-S型电动分散搅拌器，上海翎羽机电设备有限公司产品；BPX-272型电热恒温培养箱、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯设备有限公司产品。

2 试验方法

2.1 葡萄皮渣中膳食纤维的制备工艺流程

2.2 操作要点

2.2.1 葡萄皮的预处理

称取一定量的葡萄皮渣，在60～70℃的干燥箱内干燥12 h，然后用粉碎机打成碎末，使用60目筛进行筛选，筛出来的粉末即为试验用葡萄皮渣，收好后备用。

2.2.2 蛋白酶酶解

准确称取2 g预处理后的葡萄皮渣（精确至0.000 1 g）放进锥形瓶中，然后按照1∶20的比例加入蒸馏水40 mL，调节pH值至7.0左右，再加入适量蛋白酶在水浴锅中进行酶解90 min，水浴温度50℃，随后放在90℃水浴锅中，灭酶5 min后取出，待冷却到室温备用。

2.2.3 糖化酶和纤维素酶酶解

经过灭酶处理后的原料，调节pH值至5左右，再加入适量糖化酶和纤维素酶，置于60℃水浴锅中酶解90 min，随后置于90℃水浴锅中灭酶5 min取出，冷却至室温。

2.2.4 醇沉

将冷却至室温后的物料，进行离心分离（转速为4 000 r/min，时间为15 min），取上清液备用，将离心分离后的固体进行干燥后称质量，即为不溶性膳食纤维。

将上清液用其4倍体积的95%乙醇进行醇沉10 h，之后再进行离心分离（转速为4 000 r/min，时间为10 min），取所得到的固体经干燥后称质量，即为可溶性膳食纤维，将上清液进行回收。

2.3 各种营养成分的测定

水分的测定按照GB/T 5009.3—2003；灰分的测定按照GB/T 5009.4—2003；蛋白质的测定按照GB/T 5009.5—2003；脂肪的测定按照GB/T 5009.6—2003；总糖的测定按照GB/T 5009.7—2003。

2.4 试验步骤

2.4.1 蛋白酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，再分别加入0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的蛋白酶，然后按照2.2.3的工艺路线，考察蛋白酶添加量对可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.2 蛋白酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，再加入0.3%的蛋白酶，在60℃水浴锅中，分别进行水解30，60，90，120，150 min然后取出，之后参照2.2.3的工艺路线，考察蛋白酶的酶解时间对可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.3 蛋白酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶，在50，60，70，80，90℃的水浴锅中进行水解60 min后取出，之后按照2.2.3的工艺路线，考察蛋白酶酶解温度对可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.4 混合酶配比对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶于60℃水浴锅中进行水解90 min后，再放置于90℃水浴锅中进行灭酶处理5 min。取出后冷却到室温，再加入1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5的糖化酶和纤维素酶混合酶，后参照2.2.3的工艺路线，考察糖化酶和纤维素酶混合酶的最佳配比对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.5 混合酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶在60℃水浴锅中进行水解90 min后，再放到90℃水浴锅中进行灭酶5 min。取出冷却到室温后，按照1∶4的配比加入0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%糖化酶和纤维素酶混合酶，再参照2.2.3的工艺路线，考察糖化酶和纤维素酶混合酶最佳添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.6 混合酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶，在60℃水浴锅中进行水解90 min后，再放入90℃水浴锅中灭酶5 min。取出后冷却到室温，再加入糖化酶和纤维素酶混合酶（混合配比为1∶4），在60℃水浴锅中分别水解30，60，90，120，150 min取出，再参照2.2.3的工艺路线，考察糖化酶和纤维素酶混合酶最佳酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.7 混合酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

准确称取5份经过预处理的葡萄皮渣，每份2.000 0 g，加20倍葡萄皮渣质量的蒸馏水，调节pH值到中性，之后加入0.3%的蛋白酶，在60℃水浴锅中进行水解90 min后，再放置于90℃水浴锅中水浴灭酶5 min。取出冷却到室温后，加入糖化酶和纤维素酶混合酶（混合配比为1∶4），分别在30，40，50，60，70℃的条件下进行水浴90 min取出，再按照2.2.3的工艺路线，考察糖化酶和纤维素酶混合酶最佳酶解温度对可溶性膳食纤维得率的影响。

2.4.8 葡萄皮渣可溶性膳食纤维提取条件的优化正交试验

通过上述单因素试验可以发现，蛋白酶添加量、糖化酶和纤维素酶的混合酶添加量以及混合酶酶解温度和混合酶酶解时间对可溶性膳食纤维的影响比较大，所以选择4个因素3个比较优的水平进行正交试验。

葡萄皮渣可溶性膳食纤维提取条件的正交试验L9（34）因素与水平设计见表1。

正交试验L9（34）因素与水平设计

表1 葡萄皮渣可溶性膳食纤维提取条件的

2.5 葡萄皮渣膳食纤维提取结果与分析

2.5.1 葡萄皮渣成分分析

葡萄皮渣的成分含量（质量分数W/W，%）见表2。

表2 葡萄皮渣的成分含量

2.5.2 提取葡萄皮渣可溶性膳食纤维的结果与分析

（1）蛋白酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

蛋白酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图1。

图1 蛋白酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

由图1可知，随着蛋白酶添加量的逐渐增加，可溶性膳食纤维的得率不断增加。当蛋白酶的添加量达到0.3%时，其中可溶性膳食纤维的得率可以达到4.95%，达到最高值；然后随着蛋白酶添加量的不断的增加，可溶性膳食纤维的得率却不断减少。对原因进行分析认为，蛋白酶可以有效地促使可溶性膳食纤维溶出，从而增加可溶性膳食纤维的提取含量；但是当蛋白酶添加量超过0.3%后，反而不会有大量的细胞壁随蛋白酶添加量增加而被降解，因而会使可溶性膳食纤维的聚合度降低，因此可溶性膳食纤维得率下降。所以，蛋白酶添加量以0.3%为最佳。

（2）蛋白酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

蛋白酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图2。

由图2可知，随着蛋白酶酶解时间的不断增加，可溶性膳食纤维的得率也不断增加，当蛋白酶酶解时间进行到60 min时，葡萄皮渣可溶性膳食纤维的得率最高达到4.28%；但是随着蛋白酶酶解时间逐渐的增加，葡萄皮渣可溶性膳食纤维的得率却不断减少。分析后认为可能是因为葡萄皮渣内含有大量可溶性膳食纤维，蛋白酶的酶解时间过低时，葡萄皮渣可溶性膳食纤维进行的水解不完全；而蛋白酶的酶解时间过高时，膳食纤维中可溶性膳食纤维等活性生理物质进行分解，造成得率降低。所以，蛋白酶的酶解时间在60 min时最佳。

图2 蛋白酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

（3）蛋白酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

蛋白酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图3。

图3 蛋白酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

由图3可知，随着蛋白酶酶解温度的不断增加，可溶性膳食纤维的得率也不断增加，当蛋白酶的酶解温度达到50℃时，可溶性膳食纤维的得率达到最高为3.53%；随着蛋白酶酶解时间的逐渐增加，可溶性膳食纤维的得率反而不断减少。分析原因可能是因为蛋白酶在50℃左右的环境温度下，活性达到最高，在其催化作用下葡萄皮渣可溶性膳食纤维的得率最高，提取效果也最好；根据酶促反应动力学的原理，当酶处于高于最适温度的时候，随着温度不断升高，酶会逐步变性，反应速度反而下降，最终导致提取含量降低。因此，蛋白酶酶解温度以50℃为最佳。

（4）混合酶配比对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

混合酶配比对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图4。

图4 混合酶配比对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

由图4可知，随着混合酶配比的不断增加，葡萄皮渣膳食纤维的得率也在逐步增加。当混合配比在1∶4时，葡萄皮渣可溶性膳食纤维的得率达到最高值3.83%。这正是因为混合酶配比过低，糖分水解不完全，所以造成可溶性膳食纤维得率降低；而当混合酶配比过高时，葡萄皮渣膳食纤维易软化，会造成膳食纤维和半膳食纤维发生轻度的水解，也最终会导致葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率降低。因此，糖化酶和纤维素酶混合酶配比在1∶4时最佳。

（5）混合酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

混合酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图5。

图5 混合酶添加量对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

由图5可知，随着糖化酶和纤维素酶混合酶添加量的不断增加，葡萄皮渣可溶性膳食纤维的得率不断增加。当混合酶添加量在1%时，葡萄皮渣可溶性膳食纤维的得率达到最高为3.75%。这是因为当混合酶添加量过低时糖分水解不完全，易造成可溶性膳食纤维得率降低；而混合酶添加量过高，膳食纤维易软化，会造成膳食纤维和半膳食纤维发生轻度水解，也会导致葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率降低。因此，糖化酶和纤维素酶混合酶最适添加量为1%时最佳。

（6）混合酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

混合酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图6。

由图6可知，随着糖化酶和纤维素酶混合酶酶解时间的不断增加，葡萄皮渣膳食纤维的得率也在逐渐增加。当酶解时间在90 min时，葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率达到最高值为6.18%。这是因为当酶解时间过短，糖类物质水解不完全；而酶解时间过长，提取液黏度增加，使纤维素溶出减少而得率降低。因此，糖化酶和纤维素酶混合酶酶解时间在90 min时为佳。

图6 混合酶酶解时间对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

（7）混合酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响。

混合酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响见图7。

图7 混合酶酶解温度对葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的影响

由图7可知，随着糖化酶和纤维素酶混合酶酶解温度的不断增加，葡萄皮渣膳食纤维的得率也在逐渐增加。当酶解温度在60℃时，其得率达到最高为4.02%；随着酶解温度的进一步的增加，葡萄皮渣膳食纤维的得率反而不断减少。这是因为葡萄皮渣内含有大量糖类和不溶性纤维，当酶解温度过低时，糖类和不溶性纤维水解不完全；而当酶解温度过高，容易使葡萄皮渣膳食纤维中可溶性纤维素等活性生理物质分解，造成得率降低。所以，糖化酶和纤维素酶混合酶酶解温度在60℃时为最佳。

（8）最佳提取工艺的确定及正交试验结果与分析。

葡萄皮渣可溶性膳食纤维提取条件的L9（34）正交试验结果见表3。

由表3正交试验的极差R可知，各因素对提取效果影响的主次关系依次为D＞C＞B＞A，即混合酶酶解时间＞混合酶酶解温度＞混合酶添加量＞蛋白酶添加量。确定提取葡萄皮渣可溶性膳食纤维的最佳方案为A2B3C2D3，即混合酶酶解时间120 min，混合酶酶解温度60℃，混合酶添加量1.2%，蛋白酶添加量0.3%，通过试验验证其重复性较好。

3 讨论

通过多酶法工艺来制备葡萄皮渣中膳食纤维，其最大的优点是先通过蛋白酶分解葡萄皮渣中的蛋白质，然后再同时使用糖化酶和纤维素酶的混合酶来分解葡萄皮渣中的多糖，从而使可溶性膳食纤维溶出更多，而且采用多酶法工艺制备对膳食纤维损伤比较少，最终得到的膳食纤维色泽为浅黄色、纯度也比较高。

表3 葡萄皮渣可溶性膳食纤维提取条件的L9（34）正交试验结果

蛋白酶在试验过程中主要起到分解葡萄皮渣中蛋白质的作用，纤维素酶主要作用是将皮渣中的纤维素转化为葡萄糖，并且不断降解不溶性膳食纤维，破坏其分子间结构，进一步促使不溶性膳食纤维转化为可溶性膳食纤维，从而达到提高葡萄皮渣可溶性膳食纤维得率的目的。

在试验过程中，采取糖化酶和纤维素酶同时加入，结果发现糖化酶和纤维素酶依次加入与糖化酶和纤维素酶同时加入对试验的最终结果影响比较小，可忽略不计；而且糖化酶和纤维素酶同时加入，还可以缩短酶解的时间、节省试验工序，因此将糖化酶和纤维素酶同时加入。

4 结论

在葡萄皮渣中提取可溶性膳食纤维，酶的添加量、混合酶酶解时间、混合酶酶解温度、混合酶配比是影响其得率的主要因素。

通过正交试验数据发现，混合酶酶解时间120 min，混合酶酶解温度60℃，混合酶添加量1.2%，蛋白酶添加量0.3%时，为多酶法提取葡萄皮渣中可溶性膳食纤维的最优方案。

目前，膳食纤维正逐渐成为食品和销售的重要构成部分，可溶性膳食纤维因其性能优良、使用便捷，已逐步成为食品行业的宠儿，其市场所占比例一直呈上升趋势。当前，世界老龄化人口问题非常严重，而在老龄化人群中常见的高血压、高血脂、便秘、癌症等都或多或少与纤维摄入量不足有关系。而我国的老年人口总数居世界之最，据统计局相关数据表明，截至2015年末，我国60周岁及以上老年人口已经多达2.22亿人，占到全国总人口的16.1%，因此大量研究、开发适宜老年人的食品，特别是种类多样化的纤维食品，是今后食品工业发展的方向之一。

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Extraction of Soluble Dietary Fiber from Grape Skin Study on the Application of Yogurt Products

FAN Liu1，2，*HUANG Wenshu1，ZHANG Yongzhong2

（1.College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830091，China；2.Xinjiang Jiuding Agricultural Group Co.，Ltd.，Urumqi，Xinjiang 830009，China）

In this paper，a by-product wine plant grape pomace as the raw material，using multi enzyme method in which activation of dietary fiber，increased soluble dietary fiber from grape pomace（SDF）content.By single factor and orthogonal experiment，obtained activation grape pomace（SDF） optimum reaction conditions for protease addition the enzyme is 0.3%，glucoamylase and cellulase（mixed enzyme）the optimum ratio，enzyme dosage，enzymolysis temperature，enzymatic hydrolysis time is 1∶4，1.2%，60℃，soluble dietary fiber and 120 min.

grape skin dregs；soluble dietary fiber；extraction

TS209

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.007

1671-9646（2017）01a-0023-06

2016-11-18

樊 柳（1986— ），女，在读硕士，研究方向为食品工程。

*通讯作者：黄文书（1975— ），女，博士，教授，研究方向为农产品加工与贮藏。