浓香型白酒产糖化酶菌株筛选及产酶条件研究

冯瑞章，庞建义，王 涛 *，游 玲

（1.宜宾学院 发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川 宜宾 644000；2.宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644000）

浓香型白酒的生产依赖于生产环境内众多微生物的协同参与。微生物作用下高分子化合物的降解、代谢产物的相互作用是决定白酒产量和品质的关键因素[1-3]。糖化酶又称为淀粉酶（amylase），是葡糖淀粉酶（glucoamylase EC.3.2.1.3）的简称，主要由酿造环境中的霉菌代谢产生[4-6]。因该酶能够将淀粉水解为葡萄糖而在浓香型白酒酿造中发挥重要作用，行业内普遍认为淀粉质原料糖化发酵不完全是浓香型白酒产酒率偏低的主要原因[7-9]。随着白酒工业的发展，利用糖化酶作为糖化剂提高白酒出酒率，已被众多白酒企业普遍采用[10]。因此，筛选优良产糖化酶菌株，对浓香型白酒生产降低能源消耗和生产成本具有重要意义。

本研究对分离自宜宾多粮浓香型白酒曲房空气的产糖化酶菌株进行筛选，对产酶能力较强的1株菌进行产酶条件研究，以期获得高产糖化酶的菌株及其适宜的产酶条件，为扩大微生物菌种资源的开发和微生物糖化酶的生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

分离自宜宾浓香型白酒曲房空气中的14株霉菌菌株，于宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室保存。

1.2 培养基

（1）透明圈培养基[11]：可溶性淀粉10g、琼脂20g、蒸馏水1000L，自然pH值。

（2）发酵摇瓶培养基[11]：碳源10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸馏水1000mL，自然pH值。

1.3 方法

1.3.1 高产糖化酶菌株的筛选

将保存菌株活化后，制备孢子悬液，调整浓度至107CFU/mL，点接10μL 于透明圈培养基上，37℃培养6d，检测菌落直径（d）及其周围透明圈直径（D）的大小，计算D/d 值，筛选D/d 值最大的1株菌进行酶学特征研究。

1.3.2 菌株糖化酶活力测定

于150mL三角瓶中装入50mL液体发酵培养基，接种1mL浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，30℃、130r/min培养5d，发酵结束以后，取发酵液于离心管中，在6000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液。按照张娥等[12]及MICHELINM等[13]的方法，将糖化酶分离纯化。经分离纯化的糖化酶按照GB 8276—2006《糖化酶制剂》中要求测定[14]。酶活力的定义：在分析条件下，1mL粗酶液1h水解底物释放出1mg葡萄糖的酶量为1个酶活单位，用U/mL表示[15]。

1.3.3 菌株糖化酶发酵特征研究

于150mL三角瓶中装入50mL分别以可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、小麦粉和玉米粉为碳源的液体发酵培养基，如1.3.2所述方法接种糖化酶菌株，培养4d后测定糖化酶活力。

1.3.4 初始pH值的影响

于150mL三角瓶中装入50mL液体发酵培养基，调节初始pH值为分别为4、5、6、7、8、9、10，接种糖化酶菌株，培养4d后测定糖化酶活力。

1.3.5 发酵温度的影响

于150mL三角瓶中装入50mL液体发酵培养基，接种1mL浓度为107CFU/mL的孢子悬浮液，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下摇床培养4d，测定糖化酶活力。

1.3.6 溶解氧的影响

同一规格和型号的150mL三角瓶中盛入不同体积（25mL、50mL、75mL、100mL、125mL）的液体发酵培养基，接种糖化酶菌株，培养4d后测定糖化酶活力。

1.3.7 菌株的耐受酒精性

于150mL三角瓶中装入50mL液体发酵培养基，调节酒精度分别为2%vol、5%vol、8%vol、12%vol、16%vol，接种糖化酶菌株，培养4d后测定糖化酶活力。

1.4 数据分析

用Excel 2003和SPSS13.0软件对实验数据进行方差分析和显著性测验。

2 结果分析

2.1 高产糖化酶菌株筛选

透明圈直径（D）、菌落生长直径（d）及其比值是表征菌株糖化酶能力高低的一个指标。将14株糖化酶菌株分别接种于透明圈固体培养基上培养6d后（见表1），发现9株菌可以产生明显的透明圈（D≥1.60cm），其中J8M-53 菌株产生的透明圈最大（2.70cm），D/d值可达到1.74，说明该菌株产糖化酶能力明显高于其他菌株。因此，选择J8M-53菌株作为出发菌株，进一步研究其产酶条件。

表1 产糖化酶菌株筛选Table 1 Screening of highly glucoamylase-producing strain

2.2 发酵时间对菌株发酵产糖化酶活力的影响

将J8M-53菌株接种于发酵培养基中培养，考察培养时间对该菌株产糖化酶能力影响，结果见图1。随发酵时间的延长，糖化酶活性逐渐增加，培养96h后，酶活达到最高值，随着发酵时间的继续增加，糖化酶活性呈逐渐下降趋势。值得注意的是，在发酵初始阶段（0～48h），酶活力增加相对缓慢，48h以后，其活性迅速增加，72h和96h时的酶活分别为24h时酶活性的5.8和7.2倍，为48h时酶活性的2.8和3.6倍；在96h～144h时，酶活性降低速度相对缓慢，说明糖化酶发挥作用的时间段较长。

图1 菌株产糖化酶动态Fig.1 The glucoamylase activity trend of J8M-53

2.3 培养条件对菌株发酵产糖化酶活力的影响

图2 培养条件对菌株发酵产糖化酶能力的影响Fig.2 Effects of different culture condition on the glucoamylase activity of J8M-53

由图2（A）可知，虽然pH值为5.0时菌株产酶效果最好（酶活力为853U/mL），但初始pH值为4.0时，菌株依然有较强的产酶能力（635U/mL），为最大值的74%，说明该菌株有一定的耐酸能力，符合浓香型白酒生产对菌株耐酸性的要求。当初始pH值大于6以后，糖化酶活性急剧降低。

发酵温度对菌株糖化酶活性的影响见图2（B），在一定温度范围内（15℃～30℃），菌株糖化酶活性与温度增加呈正相关，当发酵温度为30℃时，糖化酶活性达到峰值，温度超过这一阈值后，糖化酶活性开始下降，当培养温度为35℃和40℃时的酶活性分别为最大酶活性的91%和73%，说明该菌株能耐受相对的高温。

菌株在不同碳源培养条件下糖化酶活性产生明显差异。由图2（C）可知，不同碳源条件下糖化酶活性大小依次为可溶性淀粉＞葡萄糖＞蔗糖、小麦粉＞乳糖、玉米粉。虽然小麦粉和玉米粉作为碳源时的糖化酶活性较低，仅分别为最大值的57%和34%，但与其他碳源不同，这两种物质为菌株生长和代谢提供碳源的同时，也是氮源的来源，因此，结合实际生产，这两种物质发挥的作用将更为重要。

在不同的装液量下，菌株都有一定的产酶能力，说明该菌株不是专性好氧或专性厌氧微生物。由图2（D）可知，该菌株在装液量为75mL时表现最大酶活性，且在装液量为25mL和50mL时的酶活性显著高于装液量为100mL、125mL时的酶活性，说明该菌株属于好氧菌或者兼性厌氧菌，对氧的需求量较大，相对缺氧的环境将抑制其酶活性的发挥。

作为浓香型白酒生产中将淀粉水解为葡萄糖的产糖化酶菌株，需要具有一定耐酒精能力。J8M-53菌株产糖化酶的能力大小对低酒精度有一定的依赖性，高酒精浓度则对菌株的产糖化酶能力表现抑制效应。研究菌株产糖化酶活力（y）与发酵液酒精浓度（x）的相互关系发现二者呈现二次函数关系（y=-35.803x2+284.23x+542.83，R=0.967）。当酒精浓度为6%vol时糖化酶活性达到最高值（1185U/mL），此后，随着酒精浓度的增加，糖化酶活力逐渐下降，但当酒精度为12%vol 时，菌株产糖化酶的能力还保持在较高水平，该酒精浓度下的酶活力约为最高酶活力的74%，说明该菌株对酒精具有较高的耐受性。

3 结论

本研究通过透明圈法从来自浓香型白酒生产环境的14株真菌中筛选得到1株产糖化酶能力较强的菌株，以液体培养的方式，探索了培养时间对该菌株产糖化酶能力的影响，确定最佳产酶时间为96h。通过单因素试验研究pH值、培养温度、碳源及溶解氧对菌株产糖化酶的影响，发现该菌株产酶的最适初始pH值为5，但在初始pH值为4时糖化酶活性为最大值的74%；最适培养温度为30℃，但温度达到40℃时的糖化酶活性最大值的74%；最适的碳源为可溶性淀粉，但对其他碳源都有一定的利用；该菌株属于好氧菌或者兼性厌氧菌，相对缺氧的环境将抑制酶活性的发挥。菌株产糖化酶的能力对培养液的酒精浓度有一定的依赖性，当培养液的酒精浓度为6%vol时，酶活力可以达到1185U/mL，酒精浓度为12%vol时，酶活可以达到873U/mL，约为最大值的74%。

综上所述，J8M-53菌株具有较好的环境适应能力，在一定程度上具有耐酸、耐高温、耐酒精及碳源利用率广泛的特点。因此，在浓香型白酒生产中，如能合理利用，将在提高浓香型白酒的原料利用率和出酒率方面发挥重要作用。

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