急性低氧运动中大鼠前额皮质TRPV4通道蛋白的免疫组化研究

黄 兴， 朱镕鑫, 霍彩云, 唐玉玲, 韩天雨, 于加倍， 张玮佳， 胡 扬

(1.北京体育大学运动人体科学学院，北京 海淀 100084 ； 2.首都体育学院运动科学与健康学院，北京 海淀 100191；3.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193 ； 4.北京体育大学中国运动与健康研究院，北京 海淀 100084)

瞬时感受器电位离子通道家族香草素受体亚家族Ⅳ型(Transient Receptor Potential Vanilloid 4，TRPV4)通道对于细胞内钙离子的调控起重要作用[1-2]。人们发现，TRPV4通道是一种能被因低渗引起的细胞肿胀而激活的离子通道[3-4]，可被温热、机械、花生四烯酸及其代谢物等多种刺激所激活[5-6]。在中枢神经系统中，TRPV4通道主要分布于大脑皮层、海马、丘脑、小脑等部位[7]。研究前额皮质TRPV4通道在低氧环境中运动时的变化，对于后期深入研究低氧运动中前额皮质神经细胞钙离子通道的变化情况将奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 本研究以120只体重在280～300 g的Wistar大鼠为研究对象，购自北京维通利华实验动物中心。动物实验经过北京体育大学动物福利论理委员会批准，动物分笼饲养，室温20 ℃～24 ℃，相对湿度40%～60%，每日12 h光照/12 h熄灯，国家标准啮齿类动物常规词料喂养，大鼠自由饮水、采食。普通动物房模拟平原常氧状态，采用模拟低氧发生器在低氧房分别模拟海拔2 500 m(低氧1)和4 500 m低氧(低氧2)状态。将大鼠随机分为12组，每组10只，分别是常氧-安静组(常-安组)、常氧-5级组(常-5级组)、常氧-8级组(常-8级组)、常氧-力竭组(常-竭组)、低氧1-安静组(低1-安组)、低氧 1-5 级组(低1-5级组)、低氧1-8级组(低1-8级组)、低氧1-力竭组(低1-竭组)、低氧2-安静组(低2-安组)、低氧2-5级组(低2-5级组)、低氧2-8级组(低2-8级组)、低氧2-力竭组(低 2-竭组)。

1.2 大鼠适应跑台训练方案 大鼠适应跑台训练5 d，速度为10 m/min，每天15 min。大鼠适应跑台训练期结束后间隔1 d，进行递增负荷运动，并按照图1所示的流程进行剖检取材。

图1 取材流程

1.3 大鼠递增负荷运动方案 大鼠的递增负荷运动方案参照Leadro基于Wistar大鼠最大摄氧量测试模型。采用逐级递增负荷进行测试。坡度不变，10°倾斜角，起始速度5 m/min，最大速度50 m/min。第一级负荷持续时间为4 min，此后每一级负荷持续3 min，直至力竭[8]。

1.4 取材 用3%戊巴比妥钠(0.25 mL/100 g体重)腹腔注射麻醉。待麻醉好后，腹主动脉取血并迅速取出脑组织，切下部分前额皮质置于4%甲醛中固定。

表1 大鼠递增负荷运动方案[8]

1.5 石蜡切片和H.E.染色 将固定好的前额部分用梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、石蜡切片，每个大脑连续切片，5张取一张，共取6张。常规苏木素伊红染色，奥林帕斯显微镜BX43观察拍照。

1.6 免疫组化染色 (1)石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，下行至蒸馏水；(2)PBS洗3次，每次5 min；(3)3%过氧化氢室温避光作用20 min；(4)蒸馏水洗，PBS洗3次，每次5 min；(5)5%牛血清白蛋白封闭液室温作用30 min；(6)倒掉封闭液后，滴加已稀释好的一抗(兔源TRPV4多克隆抗体1∶200倍稀释)，4 ℃过夜；(7)PBS洗3次，每次5 min；(8)滴加试剂1(聚合物辅助剂)，37 ℃作用30 min；(9)PBS洗3次，每次5 min；(10)滴加试剂2(辣根过氧化物酶多聚体标记的山羊抗兔IgG)，37 ℃ 作用30 min；(11)PBS洗3次，每次5 min；(12)滴加DAB显色液，室温避光作用2～10 min，显微镜下控制显色时间；(13)蒸馏水洗，苏木素染液作用5 min；(14)蒸馏水洗，1%盐酸酒精分色10 s，经0.1 mol/L pH值7.4 PBS蓝化作用15 min；(15)经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封片，镜下观察。同时设染色对照，即一抗替代为PBS。评级方法：0=没有阳性细胞；1=1～5个阳性细胞；2=6～10个阳性细胞；3=11～15个阳性细胞；4=16～20个阳性细胞；5=多于20个阳性细胞。

2 结果

2.1 H.E.染色结果 各组脑组织病理变化如中插彩版图2所示。

图2 大脑前额皮质HE染色图(H.E. 40×)

注：黑色箭头指示水肿，空三角指示淤血，三角形指示嗜神经现象，五角星指示结构疏松、偶见淋巴细胞浸润。A：常-安组，B：常-5级组，C：常-8级组，D：常-竭组，E：低1-安组，F：低1-5级组，G：低1-8级组，H：低1-竭组，I：低2-安组，J：低2-5级组，K：低2-8级组，L：低2-竭组

常氧组：第5级小鼠脑组织可见水肿，血管与周边组织间隙增宽；第8级脑组织可见水肿、血管扩张充血；力竭组可见脑膜下静脉淤血。

低1组(2 500 m组)：第5级可见脑组织小血管扩张充血，第8级可见胶质细胞嗜神经现象，静脉淤血；力竭组可见脑膜疏松水肿、脑膜下和皮质部静脉淤血。

低2组(4 500 m组)：安静组可见小血管扩张充血现象；第5级静脉淤血，可见胶质细胞嗜神经现象；第8级可见胶质细胞嗜神经现象，脑膜下静脉淤血；力竭组细胞间组织疏松，神经细胞排列紊乱，脑膜下淤血出血、淋巴细胞浸润。

2.2 免疫组化结果 如中插彩版图3和图4所示，TRPV4阳性信号显示为棕黄色，主要分布在神经细胞和胶质细胞中。无论在常氧环境还是低氧环境，随着运动强度的递增，大鼠大脑前额皮质TRPV4的表达量显著增高，各环境下5级、8级和力竭组均显著高于同环境安静组(P<0.01)。

安静状态下，低1-安组TRPV4表达量显著高于常-安组(P<0.05)，低2-安组与常-安组比具有非常显著性差异(P<0.01)；5级状态下，低2～5级组与常-5级组比具有非常显著性差异(P<0.01)；8级状态下，低1～8级组与常-8级组比具有显著性差异(P<0.05)，低2～8级组与常-8组相比具有非常显著性差异(P<0.01)；力竭状态下，低1-竭组和低2-竭组与常-竭组比均具有显著性差异(P<0.05)。

图3 大脑前额皮质TRPV4蛋白免疫组化染色图(IHC, 40×)

注：箭头所示为TRPV4阳性信号。A：常-安组，B：常-5级组，C：常-8级组，D：常-竭组，E：低1-安组，F：低1-5级组，G：低1-8级组，H：低1-竭组，I：低2-安组，J：低2-5级组，K：低2-8级组，L：低2-竭组

图4 大脑前额皮质TRPV4免疫组化阳性统计结果

3 讨论

TRPV4通道最早是于2000年由Liedtke等人提出[9]。人类的TRPV4基因存在于12q23～q24染色体上，表达于第15号外显子上[10]。目前己确定TRPV4的5种亚型，分别是TRPV4-A～E。细胞内质网中蛋白质储留、低聚反应缺失和通道失活的现象可由亚型B, C和E在N-末端锚蛋白重复结构域(ANK)的缺失所导致[11-12]。结构上，TRPV4通道蛋白由871个氨基酸组成，氨基端和羧基端均位于胞质侧，其具有6个跨膜区(S1-6)，在S5与S6区之间有一个发卡通道结构，形成孔通道环，该孔通道环允许钙离子等阳离子通过[13-14]。TRPV4通道蛋白约30%体积位于胞膜上，约70%暴露于细胞内或细胞外，该结构特点为其与细胞内外的蛋白相互作用从而调节通道的功能提供了极大便利[15]。起初，人们发现TRPV4通道是一种能被因低渗引起的细胞肿胀而激活的离子通道[3-4]。后续研究表明，TRPV4通道还可被温热、机械、花生四烯酸及其代谢物等多种刺激所激活[5-6]。在中枢神经系统中，TRPV4通道主要分布于大脑皮层、海马、丘脑、小脑等部位[7]。

大脑缺血缺氧时，主要通过以下两方面激活TRPV4通道：一方面，大脑缺血缺氧造成细胞水肿，因而通过改变细胞膜机械张力激活TRPV4通道；另一方面，大脑缺血缺氧造成能量代谢障碍，产生的大量花生四烯酸(AA)通过其代谢产物5,6-环氧二十碳三烯甘油酸(5,6-EET)等也能激活TRPV4通道[16]。

H.E.染色结果显示，4 500米海拔高度运动至第5级，静脉淤血现象明显，与常氧运动第8级所出现的症状相似；4 500米海拔高度第8级，脑膜疏松水肿、脑膜下静脉淤血，与常氧力竭和2 500 m海拔高度力竭所出现的症状相似。随着海拔高度的升高，低氧刺激可导致大强度运动大鼠前额皮质细胞肿胀、静脉出血、脑膜下静脉出血等现象更加明显，可能是运动疲劳提前的重要原因。

免疫组化结果显示，常氧环境中随着运动强度的不断递增，TRPV4表达量增高，结合H.E.染色结果，可能由于运动导致大脑缺氧，进而细胞膜张力改变，激活了TRPV4通道。同时，模拟海拔高度的增加，即环境氧浓度的降低，也明显改变了大鼠前额皮质TRPV4的表达量。即使安静状态下，2 500 m海拔高度TRPV4的表达量也会显著高于常氧，4 500 m海拔高度的TRPV4表达量非常显著性增高。三组组间同级比较，也均有显著差异，说明低氧环境可对运动大鼠TRPV4的表达量有显著影响，为后期深入研究低氧环境下中枢神经细胞膜钙离子通道变化所致的运动疲劳提前出现奠定了基础。

4 结论

首先，大鼠急性低氧环境递增负荷运动较常氧提前出现大脑前额皮质组织病理变化。其次，低氧环境可导致运动大鼠脑前额皮质组织中TRPV4通道蛋白表达量显著升高。

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