石河子地区主要猪场猪流行性腹泻流行情况及防控调查

黄 新 ， 韩猛立 ， 张星星 ， 吴桐忠 ， 何延华 ， 钟发刚

(新疆生产建设兵团动物疾病防控重点实验室 新疆农垦科学院 ， 新疆 石河子 832000)

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种急性、高度传播性的肠道疾病。该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征。各年龄猪均易感，尤其是哺育仔猪，发病率为100%，死亡率为80%～100%。2010年来，该病在我国大部分地区均有流行[1]。2013-2015年期间，石河子市及周边地区多个猪场出现2周龄内仔猪腹泻死亡的群发病例。为了弄清发病病原及流行情况，我们采集了该地区有腹泻流行部分猪场的粪便样本，进行RT-PCR检测，调查该地区PED的流行及防控情况，为该疫病的诊断和预防提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2013年5月-2015年12月样品采集于石河子地区的莫索湾、安集海、下野地垦区和石河子市周边，样品来自该区域29个流行仔猪腹泻猪场的487份肛拭子，置于-80 ℃保存备用。猪群主要来自1～15日龄的新生仔猪，有临床症状的样本的猪主要表现为呕吐、水样腹泻。

1.2 试剂与材料 RNA提取试剂盒，购自Invitrogen公司的TRIZol；反转录(AMV)试剂盒、TaqDNA 聚合酶(含10×Buffer)、dNTP，DL-2 000 bp DNA Marker、胶回收试剂盒、pMD18-T连接试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品，基因组提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品，DH5α由本实验室保存。

1.3 扩增猪病毒性腹泻的引物设计及合成 根据GenBank PEDV M蛋白相对保守序列设计3条引物，Fm1:5′- GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3′; Rm1:5′- TGGAATGCAGACCTGTCG-3′; Rm2: 5′- AGACCACCAAGAATGTGTCC-3′;由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 样本的处理及病毒总RNA的提取 使用PBS将肛拭子肠内容物制成10%悬液，混匀，3 000 r/min(4 ℃)离心10 min。取上清400 μL，使用TRIZol法提取样品中的总RNA。

1.5 RT-PCR扩增 PEDV特异性片段及克隆测序 首先以反转录引物Rm1进行反转录，合成cDNA，反应采用10 μL体系：模板RNA 5.5 μL，20 μmol/L引物Rm1 0.5 μL，70 ℃保温10 min后，在冰上速冷2 min，加入5×M-MLV Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.25 μL,200 U/μL RTase M-MLV 0.25 μL, DEPC水补至10 μL，瞬时离心后42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，4 ℃存放备用。以此为模板，使用引物Fm1/Rm1进行PCR第1次扩增，然后使用一扩产物1 μL分别使用引物Fm1/Rm2进行第2次扩增。PCR反应条件如下：94 ℃变性5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 30个循环；72 ℃延伸10 min。两次的反应条件相同。反应结束取第2次扩增的PCR产物 5 μL，用15 g/L的琼脂糖电泳检测扩增结果。

1.6 石河子部分地区猪流行性腹泻病初次和再次流行特征调查 使用调查问卷及定期回访的形式对石河子部分地区发病猪场猪流行性腹泻持续追踪和现场调研。

2 结果

2.1 发病的流行特点及临床症状 发病猪场1～3日龄新生仔猪出现腹泻，3～5日龄死亡率最高，能耐过15日龄的仔猪逐渐症状减轻，但往往生长不良；部分生产母猪厌食、发热和呕吐，其他猪群偶有腹泻，1周即康复。发病仔猪主要继发性水样腹泻，黄色或灰白色，恶臭同时伴有体温升高，后消瘦，被毛粗乱、精神委靡不食、全身衰竭，使用抗生素等药物无效。

2.2 目的片段RT-PCR的扩增结果 以肠内容物提取的RNA为模板，反转录后使用引物Fm1/Rm1一扩，用其产物分别使用Fm1/Rm2 (图1)，获得预期大小(412 bp)PEDV特异性片段，与预期结果一致，见图1。后克隆测序，为预计目的基因序列。

图1 样本中PEDV PCR的扩增

M: DNA分子质量标准; 1-7: Fm1/Rm2二扩结果

2.3 石河子部分地区猪流行性腹泻病病原调查情况 将采集的石河子部分地区及周边29个猪场487份样品RT-PCR结果进行分析，结果显示，该地区猪流行性腹泻病原感染阳性率从30.0%～87.5%。其中石河子市周边的145团阳性率最高，达到了87.5%，猪场平均阳性率为75.9%(22/29)，见表1。

2.4 石河子部分地区猪流行性腹泻病初次和再次流行特征分析

2.4.1 发病地区初次流行特征 对发病猪场调查发现，四季都有发病，没有明显的季节性特点。但距离相近的猪场发病时间间隔较短，按时间来看，首先是石河子周边的石河子总场、沙湾先发病，其次是莫索湾148团、149团发病，最后是下野地和安集海地区见表1。

表1 石河子地区猪流行性腹泻病原检测结果

2.4.2 发病地区再次流行特征 对发病地区持续调查发现，有15个猪场(其他13个猪场数据不详)在初次流行该病时，发病率达50%～95%，经过8～12个月后，新生仔猪腹泻的发病率下降到15%～20%。但死亡率多在90%以上，表现在某窝或某几窝仔猪全部死亡；发病猪妊娠时同圈母猪产仔正常，与发病仔猪邻窝猪群也生长正常。发病母猪表现产后厌食、高热和呕吐等症状，3～6 d恢复正常，其仔猪常常消瘦脱水而死亡。

2.5 石河子部分地区猪流行性腹泻病流行猪场采取的防控策略及效果

2.5.1 流行前后采取的防控策略 通过对石河子市及周边地区29个猪场的防疫情况及流行发病后所采取的防控出来方案进行调查，猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗已经作为日常免疫程序的猪场23个，按照4个月1次对母猪进行普免；2个猪场在腹泻流行期前2个月免疫过该灭活苗；没有接种该疫苗的猪场有3个。

流行该病后，16个猪场对全群母猪紧急接种了猪猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎二联灭活疫苗，其中2个猪场在发病后，连续3个月紧急接种该灭活疫苗，1次/月；5个猪场采取给产前母猪喂食腹泻仔猪排泄物；另外5个猪场没有采取注射疫苗的手段，仅仅使用每天及时清除腹泻物、消毒及抗生素等策略。

2.5.2 防控效果 不论是流行前还是流行后采取以上一种或多种防控方案的猪场，都没有取得有效控制该病的结果。

3 讨论

本工作中调查了石河子莫索湾、安集海、下野地和石河子市周边地区29个有腹泻症状的猪场，检测猪流行性腹泻病毒流行和防控情况，为该病的确诊及进一步防控提供了依据。检测发现487份肛拭子样品中，304份样品阳性，平均阳性率62.4%，不同地区的阳性率差异较大(30.0%～87.5%)。29个猪场中22个猪场猪流行性腹泻病毒阳性，平均阳性率75.9%。可以确认猪流行性腹泻病毒是引起新生仔猪群腹泻疫情的主要病原。在检测PEDV病原时，从部分猪场的脏器中也分离到了致病性大肠杆菌，可能加重了一些猪场仔猪腹泻和死亡。

免疫疫苗本是防控该病的主要手段，但是本调查中75.9%(22/29)的猪场在此疫情之前都已经免疫猪流行性腹泻疫苗，所有的猪场都紧急接种了该疫苗，同时2个猪场连续3个月对猪场母猪普免疫苗，但都没有取得明显的效果。内地多个地区的免疫猪场都没有逃脱该病的流行[2-3]。资料表明，多地流行株与疫苗毒株CV777遗传关系较远，可能是该病流行的主要原因[4-5]。

[1] 常铁城,陈建飞,冯力，等.2014年部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2016,38(4):335-338.

[2] 赵振鹏,杨振,林伟东,等.江苏省猪流行性腹泻病毒的流行病学调查[J].安徽农业科学,2015,43(19):125-127.

[3] 董彦鹏,白娟,范宝超,等．猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测与ORF3基因分子流行病学调查[J].中国预防兽医学报,2013,35(7):555-558.

[4] 刘孝珍,陈建飞,时洪艳,等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报,2012,34(3):180-183.

[5] 施标,董世娟,朱于敏,等.中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展[J].中国农业科学, 2013,46(20):4 362-4 369.