犬细小病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

邱 薇 ， 胡挺松 ， 王文博 ， 余 静 ， 陈 刚 ， 张富强 ， 郑 颖 ， 范泉水

(成都军区疾病预防控制中心 ， 云南 昆明 650118)

由犬细小病毒引起的犬细小病毒病是一种急性、以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的犬科和鼬科动物重要传染病。CPV对外界的抵抗力强，存活时间长，故其传染性极强，各种年龄的犬都能感染，可引起犬出血性腹泻和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高，症状与猫泛白细胞减少症相似。CPV有两种不同的血清型，即CPV-1型和CPV-2型。日本、德国和美国从自然发病的猫分离到CPV-2 a型和CPV-2 b型，这些猫都出现显著的白细胞减少症。CPV-2又分为CPV-2 a型和CPV-2 b型两种亚型。近年来又出现了CPV-2 c型，每次变异都引起病毒在致病性和宿主嗜性方面的变化[1-2]。2010年，我国检测到CPV 2 c型毒株[3]，但目前我国还是以CPV-2 a型和CPV-2 b型为主要流行毒株[4]。

CPV基因组编码的结构蛋白VP1和VP2在病毒感染过程中起着极为重要的作用，缺失VP1蛋白或VP2蛋白的突变体毒株均丧失了对宿主细胞的再感染性，VP2蛋白上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围，VP1蛋白氨基酸序列包含整个VP2蛋白的氨基酸序列，且终止于共同的C端[5]。 VP1蛋白比VP2蛋白在其氨基端多出一段序列，且富含碱性氨基酸残基[6]。VP2基因的5`端以及该基因上的蛋白转角结构区loop1和loop3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导机体产生中和抗体，这些区域氨基酸残基的变化是导致CPV毒株抗原漂移的主要原因，传染性病毒粒子包含60个蛋白亚基，主要由VP2亚基、少量的VP1和VP3亚基组成[7]。有证据显示，杆状病毒或疫苗载体表达的仅由VP2组装的CPV空衣壳和真正的空衣壳在抗原性上相似，说明VP1和VP2在功能上可能具有相同的作用[8]。还有研究[9,10]表明，VP1和VP2基因均可诱导犬产生中和抗体，并能保护犬抵御强毒的攻击。

本研究从发病死亡犬的肠内容分离到1株犬细小病毒野毒株，通过PCR获得其VP1基因，测序后经基因分型，该毒株属于CPV-2 a型。利用基因免疫制备单克隆抗体的方法，构建了该毒株VP1基因的基因疫苗，获得了3株具有不同抗原表位及CPV中和活性的单克隆抗体，为CPV在临床诊断及治疗方面的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌JM109 、真核表达载体pcDNA3、猫肾F81传代细胞和SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存。 BALB/c小鼠，购自昆明医学院实验动物中心。病料取自昆明某基地死亡犬肠内容物。病毒RNA/DNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、DNA分子量标准，均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物胶回收试剂盒、质粒(小量)抽提试剂盒，购自上海华舜试剂有限公司；引物合成、纯化及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 引物的合成 合成1对扩增CPV VP1全基因的引物，上游引物中含BamH I限制位点，下游引物中含NotI限制位点，用ddH2O按20 pmol/μL稀释，-20 ℃冻存。引物序列如下：

P15′-CGGGATCCATGCTTGTGCCTCCAGGTT-3′；

P25′-GTGCGGCCGCATTTTCTAGGTGCTAGT-3′。

1.3 犬细小病毒的分离 取病犬肠内容物，以PBS作10倍稀释后，10 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.22 μm膜除菌后接种刚传代的F81细胞，37 ℃吸附1 h后，换维持液继续培养4-5 d，每天观察有无细胞病变。出现细胞病变的，待有70%左右的细胞出现病变时进行收毒。

1.4 CPV VP1基因的克隆及序列分析 用试剂盒抽提CPV总DNA，配制PCR反应体系50 μL：模板CPV DNA 2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl25 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，无菌蒸馏水31.5 μL。PCR反应条件：96 ℃ 3 min，(96 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)30个循环，最后72 ℃延伸10 min。电泳回收VP1蛋白基因片段并与用BamH I和NotⅠ双酶切后回收的pcDNA3载体进行连接，转化大肠杆菌，阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，应用DNAMAN软件进行序列分析。

1.5 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选 选择8～12周龄BALB/c小鼠，每只鼠两后肢胫前肌各注射50 μL乳化好的基因疫苗，两周后同样剂量加强免疫，融合前10 d最后1次免疫。第1次免疫后第3周和第5周分别采血，测定抗体水平。将免疫鼠的脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞的(SP2/0)融合并将融合细胞加入到含有饲养细胞的96孔培养板中，每孔50 μL，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用1∶100稀释的CPV为抗原，1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，经间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞并进行3～4次克隆纯化。

1.6 腹水的制备 将0.5 mL高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，1周后注入1×106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔。7～10 d后当小鼠腹部极度膨胀时，抽取腹水，1 500 r/min离心10 min，取上清，加等体积的灭菌甘油，混匀，放-20 ℃冰箱冻存备用。

1.7 杂交瘤细胞上清与腹水效价的测定 将杂交瘤细胞上清用PBS分别从4倍至256倍做2倍稀释，正常SP2/0细胞培养上清作阴性对照；制备的腹水用PBS从6.4×102至2.048×104做2倍稀释，正常小鼠腹水作阴性对照，分别做间接ELISA检测，每个细胞株、腹水2孔重复，取其平均OD值，OD值超过阴性对照1倍即判为阳性，其最大稀释度为抗体效价。

1.8 单克隆抗体特异性鉴定 用犬细小病毒、犬瘟热病毒、猫细小病毒、流感病毒、犬腺病毒以及F81细胞上清分别包被酶标板，加入1∶2 000稀释的腹水，进行间接ELISA，检测制备的单抗的特异性。

1.9 单克隆抗体体外中和试验 用营养液将CPV的细胞培养物稀释成200 TCID50/0.1 mL，将各单抗分别用营养液从64倍至2 056倍做2倍稀释，取每个稀释度的腹水0.1 mL加入0.1 mL病毒液，37 ℃置1 h，然后同步接种Vero细胞，每稀释度重复4孔，于37 ℃、5% CO2继续培养，观察其生长情况。同时设立病毒、阳性血清、阴性血清(正常BALB/c小鼠血清)、腹水和营养液对照。

2 结果

2.1 VP1基因扩增 经PCR扩增得到大小约为2 200 bp的片段，与预期值相符，见图1。

图1 细小病毒VP1基因PCR扩增

M:Marker DL-2 000 ; 1. 阳性对照 ； 2. 样品DNA PCR产物

2.2 pcDNA3-VP1重组质粒的鉴定 获得的重组质粒用PCR方法和BamHⅠ及NotⅠ双酶切鉴定，PCR结果为阳性，酶切结果表明重组质粒中含有2.2 Kb的片段，见图2。

图2 重组质粒的鉴定

M: Marker DL-15 000 ； 1: 重组质粒PCR鉴定 ；2: 重组质粒双酶切鉴定

2.3 VP1基因序列测定及分析 基因测序结果与标准菌株BR8155-00(CPV-2 a型)株的VP1全基因序列和氨基酸序列相比较，核苷酸同源性为99.47%，氨基酸的同源性为99.17%。在第72、185、412、532、579位及669位的氨基酸发生突变。CPV-2 a 型和CPV-2 b型只有569位氨基酸不同，569为D是CPV-2 b型特有的，569N为CPV-2 a型。本试验所测的毒株的569位的氨基酸为N，表明该毒株为CPV-2 a型。重组质粒pcDNA3-VP1即为构建的基因疫苗。

2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选 选择两只抗体较高的小鼠脾淋巴细胞进行细胞融合，以CPV为抗原，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，经间接ELISA法筛选得到3株阳性杂交瘤细胞并进行3～4次克隆纯化。

2.5 杂交瘤细胞上清与腹水效价的测定 通过细胞融合，获得3株稳定分泌抗犬细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用间接ELISA方法测定杂交瘤细胞培养上清和腹水，上清效价为1∶16、1∶32 和1∶32；腹水效价为1∶25 600、1∶51 200和 1∶51 200。见表1。

2.6 单克隆抗体的特异性鉴定 3株单抗与CPV和FPV发生反应，均不与CDV、CAV和AIV发生反应。见表2。

表1 杂交瘤细胞株上清效价测定

表2 单克隆抗体的特异性鉴定结果

+: 阳性; -: 阴性

2.7 单克隆抗体的中和试验 经病毒中和试验，3株单抗中，CPV～VP1-2和CPV～VP1-3两株单抗对病毒有较强的中和能力，腹水的中和效价均为1∶256，而CPV～VP1-1株单抗腹水的中和效价小于1∶128。

3 结论与讨论

基因疫苗由病原的保护性抗原基因及载体质粒两部分组成。应用基因疫苗制备单抗为免疫学研究及疾病治疗提供了一个全新的方法。人们可以根据需要，将针对任何抗原表位的基因克隆到真核表达载体中，免疫小鼠制备所需的抗体。对那些难以制备和纯化的抗原以及在纯化过程中其结构易被破坏的抗原来说尤为适用。对于一些烈性传染病，应用基因疫苗制备单抗，比直接用病原体作抗原要安全得多。到目前为止，已有基因免疫制备单抗的报道。Barry等以人生长激素的基因疫苗免疫BALB/c小鼠，一次融合，即克隆筛选到20株抗hGH的单抗，这是最早以基因疫苗制备单抗的报道，

从而首次证明了基因免疫制备单抗的可行性。Schmolke等以人乙型肝炎病毒E2糖蛋白基因疫苗研制出8株抗乙肝病毒的单抗，用于鉴定其病毒粒子，这为基因疫苗及其单抗的研制提供了强有力的技术支持。

为了深入研究 CPV-2 的起源、病原特性、致病机理以及诊断和防治措施，国内外学者开展了CPV-2 单克隆抗体的研究工作，用于CPV-2 浓缩与纯化、起源与抗原变异、抗原结构分析、抗CPV-2单抗S独特型抗体的研究以及用于CPV-2 抗体和抗原的检测[11]。王净等用CPV-2 a 型分离株制备了4 株单抗且与狂犬病病毒、犬瘟热病毒无交叉反应；同时建立了双抗夹心ELISA 方法，对病毒的最低检出量为4.375 μg/mL，与美国RB 试剂盒相比，符合率为95%[12]。贺英等以纯化的酵母重组表达的犬细小病毒VP2单位获得4株能稳定分泌抗犬细小病毒CPV结构蛋白VP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株，这些单抗仅与CPV及其VP2发生特异性反应，而与CDV和CAV-1及CAV-2没有交叉反应，其中2株属于IgG2b亚类，2株属于IgG1亚类[13]。刘洁等用F81培养的CPV经灭活、纯化后制备单抗，获得2 株分泌抗CPV 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，Ig亚类均为IgG1[14]。

本研究通过基因疫苗免疫制备单抗的方法制备了CPV的单抗，省去了复杂的抗原制备过程，但是由于基因疫苗的免疫效果没有纯化的病毒粒子及纯化的蛋白质的免疫效果好，使得免疫小鼠以及杂交瘤细胞上清和腹水的效价都不够高，因此该方法制备的单抗一般中和效价也不高，不适合用于细小病毒感染的治疗，但有可能筛选到特异性较好的单抗，适用于建立细小病毒快速诊断方法，为CPV的快速诊断方法的建立及改进奠定基础。

[1] Sutton D,Vinberg C,Gustaffsson A,etal.Canine parvovirus type 2c identified from an outbreak of severe gastroenteritis in a litter in Sweden[J].Acta Vet Scand,2013,55:64.

[2] Nicola D,Buonavoglia C.Canine parvovirus -A review of epidemiological and diagnostic aspects, with emphasis on type 2c[J].Vet Microbiol，2012,155(1):1-12.

[3] 张仁舟，杨松涛，冯昊，等．中国国内首次检测到犬细小病毒CPV 2c[J].中国病原生物学杂志，2010,5(4):246-249+275.

[4] Zhong Z J,Liang L Q,Zhao J,etal. First isolation of new canine parvovirus 2a from Tibetan mastiff and global analysis of the full lenth VP2 gene of canine parvoviruses 2 in China[J].Int J Mol Sci,2014,15(7):12 166-12 187.

[5] Brennan F R, Bellaby T, Helliwell S M,etal. Chimeric plant virus particles administered nasally or orally induce systemic and mucosal immune responses in mice[J]. J Virol,1999,3:930-938.

[6] Reed A P,Jones E V,Miller T J.Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus[J].J Vrol,1988,62:266-276.

[7] Brennan F R, Jones T D, Longstaff M,etal. Immunogenicity of peptides derived from a fibronectin-binding protein (FnBP) of S. aureus expressed on two different plant viruses[J]. Vaccine,1999, 17:1 846-1 857.

[8] Parrish C R.Host range relationships and the evolution of canine parvovirus[J].Vet Microbiol,1999,69:29-40.

[9] Parrish C R,0conndl P H,Evermann J F.etal．Natural variation of Canine parvovirus[J].Science,1985,230(4 729):1 046-1 048.

[10] Jang W,Baker H J,Swango L J.etal．Nudeic acid immunization protects dogs against chllenge with virulent Canine parvovirus[J].Vaccine,1998,16(6)：601-607.

[11] 田克恭．犬细小病毒单克隆抗体研究进展[J]. 中国兽医杂志，1999, 25(2):54-57.

[12] 王净， 李刚，王鹏，等．抗CPV-2a 单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA 检测方法的建立[J].基因组学与应用生物学，2011，30(3)：357-363.

[13] 贺英，史秋梅，潘素敏，等．抗酵母表达犬细小病毒蛋白VP2的单克隆抗体的制备和鉴定[J].中国兽医学报，2012,32(11)：1 629-1 633.

[14] 刘洁，何文辉，李晶梅，等．分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[J].中国兽药杂志；2013，47(7): 9-12.