葡萄糖-6-磷酸异构酶水平测定与类风湿关节炎早期诊断

徐 婧，刘 婧，朱 雷，张学武，栗占国△

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科， 风湿病机制及免疫诊断北京市重点实验室， 北大清华生命科学联合中心， 北京 100044； 2. 北京大学国际医院风湿免疫科， 北京 102206)



·论著·

葡萄糖-6-磷酸异构酶水平测定与类风湿关节炎早期诊断

徐 婧1，2*，刘 婧1*，朱 雷1，张学武1，栗占国1△

(1. 北京大学人民医院风湿免疫科， 风湿病机制及免疫诊断北京市重点实验室， 北大清华生命科学联合中心， 北京 100044； 2. 北京大学国际医院风湿免疫科， 北京 102206)

目的：探索葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)水平测定对于日常门诊中类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)早期诊断的意义，及其与RA疾病活动度的相关性。方法： 选择2010年至2012年北京大学人民医院风湿免疫科门诊中有多关节肿痛表现的关节炎患者1 051例，选取健康人90例作为对照，ELISA法检测其血清GPI水平，根据临床特点及辅助检查，符合类风湿关节炎分类标准的RA患者525例，其余患者包括骨关节炎(osteoarthritis, OA)患者134例、血清阴性脊柱关节病(seronegative spine joint disease, SpA)患者104例、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者31例、原发性干燥综合征(primary Sjögren syndrome, pSS)患者24例、痛风(gout arthritis，GA)患者22例、其他结缔组织病(包括风湿性多肌痛、皮肌炎、系统性硬化症、成人Still病等)患者46例、其他疾病(包括骨质疏松、股骨头坏死、骨髓炎、外伤所致骨和关节疾病、幼年类风湿关节炎、肿瘤等)患者165例。评估GPI的诊断价值，分析GPI阳性与阴性组RA患者在临床特点、疾病活动性、严重程度及炎性指标的差别。结果： RA患者中血清GPI的阳性率达55.4%(而其他自身免疫病为14.3%，健康对照组为7.78%，P<0.001)，相较于OA及SpA患者RA患者组滴度显著升高，差异具有统计学意义(P<0.001)。单独应用GPI诊断RA的最佳界值为0.39 mg/L，敏感性54.2%，特异性87.3%。RF阴性患者中GPI阳性率为36.1%；抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide, CCP)抗体阴性患者中GPI阳性率34.2%； RF和抗CCP抗体双阴性患者中GPI阳性率为24.1%。GPI水平与ESR、 RF、抗CCP抗体及HRF-IgG滴度呈正相关(P<0.05)。结论： GPI在RA患者中有较高的敏感性，抗CCP抗体和/或RF阴性患者中GPI阳性对RA有一定的诊断意义,GPI滴度与RA的疾病活动度可能有关。

关节炎, 类风湿；自身抗体；葡萄糖-6-磷酸异构酶

葡萄糖-6磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)是一种相对分子质量为40 000的多功能蛋白质，亦可称为磷酸己糖异构酶或磷酸葡萄糖异构酶。GPI由T细胞分泌，它除了酶活性外还具有细胞因子及生长因子样活性，其存在于各种细胞的细胞外液及细胞质，尤其是关节腔内，特别是软骨表面[1]。近年来人们逐渐认识到GPI可作为自身抗原与自身免疫病尤其是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)密切相关[2]。RA早期即可产生不可逆的骨侵蚀和关节破坏，甚至多系统均可累及，因此RA的早期诊断及规范化治疗极为重要[3]。本研究针对GPI在RA中的临床意义做了研究调查，通过更特异的酶联免疫吸附测定检测大样本血清中GPI水平，并进行非干预性回顾分析，探讨RA患者血清中GPI水平与临床和实验室指标的相关性，为RA临床诊疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选择2010年至2012年北京大学人民医院门诊或住院存在关节肿痛表现的关节炎患者病历资料，根据1987年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)或2010年ACR/EULAR分类标准确诊RA，2009年国际脊柱关节炎评价工作组(the Assessment in Spondyloarthritis International Society，ASAS)分类标准确诊血清阴性脊柱关节病(seronegative spine joint disease，SpA)，1984 年修订的AS纽约分类标准确诊AS，1995年ACR Osteoarthritis 分类标准确诊骨关节炎(osteoarthritis, OA)，1997年或2009年ACR修订的分类标准确诊系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)，干燥综合征国际分类标准确诊原发性干燥综合征(primary Sjögren syndrome, pSS)，1977年ACR分类标准或1985年Holmes标准确诊痛风(gout arthritis，GA)，1989年ACR分类标准确诊儿童类风湿关节炎(juvenile rheumatiod arthritis，JRA)，回顾性分析GPI水平及临床、实验室特点。

入组患者包括525例RA患者，平均年龄为(59.6±13.0)岁，平均病程为(12.3±10.2)年。其余有关节肿痛表现的104例脊柱关节炎患者、31例系统性红斑狼疮患者、24例原发性干燥综合征患者、22例痛风性关节炎(Gouty arthritis，GA)患者、4例儿童类风湿关节炎(juvenile rheumatiod arthritis，JRA)患者、46例其他结缔组织病[connective tissue diseases，CTD,包括ANCA相关小血管炎(ANCA associated systemic vasculitis，AASV)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatic，PMR)、皮肌炎( dermatomyositis，DM)、系统性硬化(systemic sclerosis，SSc)、成人型Still病(adult onset of Still’s disease，AOSD)、混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease，MCTD)、炎症性肠病( inflammatory bowel disease，IBD)及自身免疫性肝病(autoimmune liver disease，AILD)]患者、134例骨关节炎患者、41例骨质疏松症(osteoporosis，OP)患者、11例其他骨和关节疾病(bone and joint disease，BJD，包括股骨头坏死、骨髓炎、软骨损伤、骨先天性发育不良、骨折)患者、34例心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)患者、23例慢性肺病(chronic pulmonary disease，CPD)患者、5例神经系统疾病(neuropathy)患者、16例恶性肿瘤(malignant tumor)患者、28例感染性疾病( infectious diseases，ID)患者、3例代谢综合征(metabolic syndrome，MS)患者血清标本作为疾病对照，留取90例健康人血清作为健康对照( healthy controls，HC)。本研究开始前经北京大学人民医院伦理委员会审查批准。

1.2 研究方法

1.2.1 实验室指标 血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)：魏式法检测，>20 mm/h 为异常；C 反应蛋白(C reactive protein,CRP)：免疫比浊法检测，>7.9 mg/L 为异常；类风湿因子(rheumatoid factors,RF)：免疫比浊法检测，≥30 IU/mL 判定为阳性；IgG 类风湿因子(HRF-IgG)：采用ELISA 试剂盒(上海德波生物技术有限公司)定量法检测，≥110 IU/mL 判定为阳性；抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullina-ted peptide,CCP)抗体：采用第二代ELISA 试剂盒(德国欧蒙医学实验诊断股份公司)定量法检测，≥5 U/mL 判定为阳性；抗角蛋白抗体(anti-keratin antibody,AKA)和抗核周因子抗体(anti-perinuclear protein,APF)：间接免疫荧光法检测，滴度≥1 ∶10 判定为阳性；抗核抗体：间接免疫荧光法检测，滴度≥1 ∶20时判定为阳性；γ球蛋白(γ-globulin)：醋酸纤维素薄膜电泳法，>23.5%时判定为异常；免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)采用美国Beckman Coulter有限公司蛋白分析仪测定。

1.2.2 葡萄糖-6-磷酸异构酶测定 血清GPI水平检测应用商品化的ELISA 试剂盒(上海北加生化试剂有限公司)，≥0.2 mg/L 判定为阳性，按试剂说明书进行操作，96 孔聚苯乙烯微孔板应用抗GPI抗体包被，将血清标本加到酶标板中，孵育1 h，洗板后将酶标抗体加入板中，孵育1 h，洗板后加入底物显色液孵育15 min，反应结束后应用终止液终止反应,酶标仪检测，波长492 nm。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0软件，数据根据情况以均数±标准差、中位数和四分位数及百分数形式表达，计数资料组间比较采用Pearson’s 卡方检验；对于正态分布的计量资料，两组组间比较采用t检验，多组组间比较采用方差分析及多重比较；对于非正态分布的计量资料，或有序分类资料的组间比较采用独立样本Mann-Whitney检验或Kruskal-WallisH秩和检验；两变量间的相关性分析采用Spearman 等级相关分析法，P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA患者血清GPI滴度升高

通过ELISA法检测以下血清GPI浓度，包括RA、SpA、GA、其他炎性关节炎(包括SLE、pSS、其他结缔组织病等)、OA、OP、其他关节疾病(包括其他骨关节疾病、其他非骨关节疾病等)及健康人，血清GPI滴度分别为0.50(0.00～6.00)、0.10(0.00～4.00)、0.00(0.00～4.00)、0.00(0.00～4.00)、0.10(0.10～2.90)、0.00(0.00～4.00)、0.10(0.10～4.00)、0.10(0.00～3.08)mg/L，应用Kruskal-Wallis检验比较各组患者GPI水平，发现各组间GPI水平不同，差异具有统计学意义(P<0.001)。应用Nemenyi法进行组间多重比较， RA组GPI滴度显著高于其他各疾病组及健康人，差异具有统计学意义(P<0.001)。相较于OA及SpA患者RA组滴度升高更为显著，差异具有统计学意义(P<0.001)，提示对RA诊断可能有一定帮助(图1)。

2.2 不同分组患者中GPI阳性率差别

应用卡方检验比较不同分组患者血清GPI阳性率分布， RA组、有关节肿痛表现的其他疾病组及健康组GPI阳性率有差异，其中RA患者阳性率最高，其他疾病组其次，健康人最低，其差异具有统计学意义(P<0.001，图2A)；同样方法比较RA、SpA、GA、OA、OP、IA和其他疾病组患者GPI阳性率，差异具有统计学意义(P<0.001,图2B)。

RA, rheumatoid arthritis; SpA, spondyloarthritis; GA, gout arthritis; OA, osteoarthritis; OP, osteoporosis; IA, inflammatory arthritis; HC, healthy controls.

图1 分组后各组血清GPI浓度

Figure1 The group of serum GPI concentration

GPI, glucose-6-phosphate isomerase; RA, rheumatoid arthritis; NRD， non RA disease； SpA, spondyloarthritis; GA, gout arthritis; OA, osteoarthritis; OP, osteoporosis; IA, inflammatory arthritis; HC, healthy controls. NRD in the left refers to other diseases with swelling performance but not rheumatoid arthrits. IA in the right including SLE, pSS and other CTD patients; others include circulation, respiration, metabolism, ner-vous system diseases, chronic infection and tumor.

图2 分组后各组血清GPI阳性率

Figure2 The group of serum GPI concentration

2.2 GPI的诊断意义

为探讨GPI在RA诊断中的价值，将上述大样本做ROC曲线分析(图3)，血清GPI诊断RA的最佳诊断界值(cut off)为0.39 mg/L，曲线下面积0.72 (95%置信区间0.69～0.75)，单独应用诊断敏感性54.2%，特异性87.3%。

2.3 GPI对RA患者的补充诊断意义

为明确GPI在RA补充诊断中的意义，检测了229例RA患者血清RF、CCP、GPI，发现61例患者RF阴性，RF阴性患者中GPI阳性率为36.1%；38例患者抗CCP抗体阴性，抗CCP阴性患者中GPI阳性率34.2%；29例患者RF和抗CCP阴性，双阴性患者中GPI阳性率为24.1%(表1)， 提示GPI与其他自身抗体联合检测有助于RA的诊断。

图3 ROC曲线分析

Figure3 ROC curve analysis

表1 GPI在RA联合诊断中的意义

n=229.

2.4 RA患者血清GPI与关节畸形、血管炎等临床表现相关

RA患者血清GPI水平明显高于其他风湿病及健康对照组，为探讨GPI是否和RA临床表现相关，将RA患者分为GPI阳性组和GPI阴性组，比较两组间临床特点，并进行非参数检验。GPI阳性的RA患者畸形关节数高于阴性组，关节畸形发生率高于阴性组，且皮下结节、淋巴结肿大、血管炎等关节外表现的发生率高于阴性组(P<0.05)，而晨僵、关节疼痛、关节肿胀、合并肺间质病变及合并其他自身免疫病等发生率,差异无统计学意义(图4)。为了进一步探究RA患者出现GPI阳性结果的独立影响因素，采用Logistic回归分析，发生关节畸形(OR2.731～17.394)及血管炎(OR1.031～36.872)会影响GPI阳性率，并使其更高，而关节肿胀、关节疼痛、合并肺间质纤维化及较高的ESR、CRP、RF、Ig、γ球蛋白和HRF-IgG水平并非RA患者GPI阳性的独立影响因素(表2)。

*the incidence of all these clinical symptoms were significently higher than that of GPI negative groups.图4 GPI与RA患者临床表现的关系

Figure4 GPI and RA patients with clinical manifestations

表2 Logistic回归分析

2.5 RA患者血清GPI与疾病活动指标及多种自身抗体相关

血清GPI阳性组RA患者IgA、RF、RF-IgG、γ球蛋白均明显升高(P<0.05),血清GPI与ANA、AKA、APF无关(表3)。 相关性分析显示GPI水平与RF、抗CCP抗体及HRF-IgG滴度正相关(P<0.05，图5)。

表3 RA患者血清GPI与多种实验室指标相关

3 讨论

RA的早期诊断、早期治疗对于延缓骨关节破坏至关重要，目前RA在临床的误诊率据统计可达到40%，抗体阴性的RA患者占20%左右[4-5]，尚需新的诊断生物标志物指导临床诊疗[6]。

本研究发现，55.4%的RA患者GPI阳性，阳性率显著高于有关节肿痛表现的非RA疾病组及健康对照组，且RA患者血清GPI滴度显著高于健康人，而如SpA、OA、IA等其他各组疾病患者GPI水平与健康人相当，这一结果与Schaller等[7]最早的报道结果类似，提示GPI可能在RA的病理过程中起作用，具有一定的诊断价值，也有助于鉴别OA及SpA等疾病。而本研究GPI阳性率高于国内报道水平[8]，这可能与阳性界值选取不同有关。

A, ESR; B, anti-CCP; C, RF; D, HRF-IgG.

图5 GPI滴度与多种炎症指标、自身抗体相关性

Figure5 GPI titer with a variety of inflammatory markers, autoantibody correlation

进行ROC曲线分析显示，GPI独立诊断RA的敏感性54.2%，特异性87.3%，其特异性结果与国内报道结果类似[9-11]，而敏感性略低，可能与入组患者标准及样本量不同相关。本研究还发现，在RF阴性、抗CCP阴性及双阴性的RA患者中GPI也有较高的阳性率，这进一步说明GPI对RA有一定的诊断及补充诊断价值，可作为联合诊断指标应用于临床,但本研究仅对于RF、抗CCP抗体阴性的RA患者进行了联合诊断意义的研究，未来可进一步明确其与抗角蛋白抗体、抗核周因子抗体、抗波形蛋白抗体等RA特异性抗体联合诊断中的意义，探索多种自身抗体联合检测可能提高RA诊断的敏感性及特异性。

本研究在较大样本量下进行单因素及多因素分析，发现血清GPI和皮下结节、血管炎、淋巴结肿大、畸形关节数及手平片分期相关，与多种自身抗体及急性时相反应物(如RF、Anti-CCP、CRP、ESR和血小板计数等)显著相关，但与患者的年龄、病程、肿胀关节数、疼痛关节数等指标无相关性。这些结果提示GPI可能与关节外表现相关[12-13]，并能反映RA的骨破坏严重程度及疾病活动度。Yu等[14]研究发现GPI可能调节基质金属蛋白酶3，使RA患者内皮细胞及滑膜细胞表达上述酶增加，从而导致骨破坏。GPI与RF及抗CCP部分重叠，提示RA患者GPI的出现可能与IgG的变性和瓜氨酸化有关。

综上所述，GPI在RA患者中阳性率高，RA患者血清GPI滴度高于其他疾病患者，可能反映RA的疾病严重程度及活动度，在RA的联合诊断及病情评估中可作为重要的生物标记物。

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(2016-06-15收稿)

(本文编辑：王 蕾)

Significance of glucose-6-phosphate isomerase assay in early diagnosis of rheumatoid arthritis

XU Jing1，2*, LIU Jing1*, ZHU Lei1, ZHANG Xue-wu1, LI Zhan-guo1△

(1.Department of Rheumatology and Immunology, Perking University People’s Hospital, Key Laboratory for Rheumatism Mechanism and Immune Diagnosis, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Beijing 100044, China; 2.Department of Rheumatology and Immunology, Perking University International Hospital, Beijing 102206, China)

Objective： To explore the titer of glucose-6-phosphate isomerase (GPI) for early diagnosis of the outpatient with rheumatoid arthritis (RA) in real life, and to analyze its relationship with disease activity. Methods: In the study, 1 051 patients with arthritis were collected in the group who had joints tender and swelling, and 90 cases of healthy people as a control group. ELISA method was used to detect the serum level of GPI, and according to clinical features and laboratory test, all the patients including 525 RA patients, the other patients including osteoarthritis (OA), 134 cases of seronegative spine joint disease (SpA), 104 cases of systemic lupus erythematosus (SLE), 31 cases of primary Sjögren syndrome (pSS), 24 cases of gout arthritis (GA), 22 cases of other connective tissue diseases (including polymyalgia rheumatica, dermatomyositis, systemic sclerosis, adult Still disease) and 46 cases of other diseases (including 165 cases of osteoporosis, avascular necrosis of the femoral head, traumatic osteomyelitis, bone and joint disease, juvenile rheumatoid arthritis, tumor). The diagnostic values of GPI were assessed, and the differences between the GPI positive and negative groups of the RA patients in clinical characteristics, disease activity, severity and inflammatory index analyzed. Results: The positive rate of serum GPI in the patients with RA was 55.4%, contrasting to other autoimmune diseases (14.3%) and healthy controls (7.78%)(P<0.001). Compared with the OA and SpA patients, the RA group was increased more significantly, and the difference was statistically significant (P<0.001). The diagnostic value of GPI alone for RA was 0.39 mg/L, the sensitivity was 54.2%, and specificity was 87.3%. The positive rate of GPI in RF negative patients was 36.1%; the positive rate of GPI in anti-CCP antibody negative patients was 34.2%; the positive rate of GPI in RF and anti-CCP antibody negative patients was 24.1%. The level of GPI had positive correlation (P<0.05) with ESR, RF, anti-CCP antibody and HRF-IgG. Conclusion: GPI is sensitive in the patients with RA; GPI positive is important in the diagnosis of RA with anti-CCP antibody and/or RF negative patients. The titer of GPI is related with disease activity of RA.

Arthritis, rheumatoid; Autoantibodies; Glucose-6-phosphate isomerase

国家自然科学基金(31530020,81120108020)和北京市自然科学基金(7131015)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China (31530020, 81120108020) and Beijing Natural Sciece Foundation (7131015)

时间：2016-11-25 16：27：05

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161125.1627.006.html

R593.2

A

1671-167X(2016)06-0942-05

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.004

△Corresponding auther’s e-mail, li99@bjmu.edu.cn