脂肪间充质干细胞对博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型的治疗作用

窦晶莉 ，白 力，庞春艳，张文兰，张 伟，王永福△

(1. 包头医学院第一附属医院风湿免疫科, 内蒙古自治区包头 014010； 2. 内蒙古自治区自体免疫学重点实验室，内蒙古自治区包头 014010)



·论著·

脂肪间充质干细胞对博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型的治疗作用

窦晶莉1,2，白 力2，庞春艳2，张文兰2，张 伟2，王永福1,2△

(1. 包头医学院第一附属医院风湿免疫科, 内蒙古自治区包头 014010； 2. 内蒙古自治区自体免疫学重点实验室，内蒙古自治区包头 014010)

目的：研究脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)对博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的硬皮病小鼠的治疗效果及其可能的作用机制。方法： 选取 C57BL/6J 雌性小鼠 24 只，采用皮下注射 BLM [2 mg/(kg·d)]建立硬皮病小鼠模型，随机分为正常对照组、BLM 组、ADSCs(皮下)组 和 ADSCs(静脉)组，每组6只，正常对照组给予生理盐水2 mL/(kg·d)皮下注射，其余3组分别给予BLM皮下注射，连续3周，然后，ADSCs皮下和尾静脉注射组分别给予皮下和尾静脉注射 ADSCs(2×105个细胞)治疗，每4天1次，共3次。流式细胞术检测小鼠脾细胞中的辅助T细胞17(T-helper 17,TH17)及 调节性T细胞(regulatory T cell ，Treg)，实时荧光定量聚合酶联反应( polymerase chain reaction,PCR)法检测小鼠肺组织中相关细胞因子的表达水平，酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA) 检测小鼠血清中白介素(interleukin,IL)-6、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β) 的含量， 苏木精-伊红染色(hematoxylin eosin staining，HE )观察小鼠的皮肤和肺组织病理学改变。结果： 流式细胞术结果显示，BLM 组较正常对照组小鼠脾细胞中 TH17 和 Treg所占比例升高(15.30%±1.29 %vs. 4.32%±0.79%；9.90%±1.95%vs. 5.18%±1.35%，P均<0.05)，经 ADSCs 治疗后，TH17 所占比例降低(5.02%±0.83%,6.00%±0.82%vs.15.30%±1.29%，P均<0.05)，而 Treg所占比例升高(14.32%±1.59%,11.09%±4.31%vs. 9.90%±1.95%，P均<0.05)。与正常对照组相比，BLM 组小鼠肺组织中 IL-17、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的 mRNA 表达水平及血清中 IL-6 的含量均升高[3.54±0.30,10.65±0.66, 5.37±0.52vs. 1.00±0.00; (21.2±1.74) ng/Lvs. (16.87±1.09) ng/L，P均<0.05]，ADSCs 治疗后，其表达量下降[1.63±0.45,1.50±0.29vs.3.54±0.30;3.11±0.85,2.98±0.76vs.10.65±0.66;1.45±0.47,1.59±0.41vs. 5.37±0.52; (17.87±1.45) ng/L, (17.61±1.16) ng/Lvs. (21.2±1.74) ng/L，P均<0.05]，ADSCs(皮下)组和ADSCs(静脉)组比较差异无统计学意义(P>0.05)。BLM 组小鼠血清中 TGF-β 的含量较正常对照组升高[(33.95±2.49) ng/Lvs. (28.8±2.29) ng/L，P<0.05]，但小鼠肺组织中 TGF-β mRNA 的表达水平与正常对照组之间差异无统计学意义( 1.17±0.11vs.1.00±0.00，P>0.05)，经 ADSCs 治疗后 TGF-β基因和蛋白的表达无明显变化[1.25±0.11,1.26±0.12vs.1.17±0.11; (31.84±2.04) ng/L, (31.25±2.36) ng/Lvs. (33.95±2.49) ng/L，P>0.05]。HE 染色结果显示，BLM组与正常对照组相比，肺组织有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔断裂或消失；皮肤真皮层增厚,有大量的胶原纤维积聚，经ADSCs治疗后小鼠肺组织炎症有所改善，皮肤的真皮层变薄，胶原纤维积聚减少。结论： ADSCs 可以有效缓解硬皮病小鼠肺的炎症和皮肤的纤维化症状，其抗炎和抗纤维化作用与其免疫调节功能有关。

干细胞, 间充质；硬皮病；免疫调节；细胞因子类

硬皮病是一种以皮肤增厚和局限或弥漫性纤维化为特点的自身免疫性疾病，可累及肺、肾、 肝、心脏等器官，发病机制未明。目前研究发现，疾病主要涉及小血管病变、细胞外基质过量积聚所致的纤维化和免疫异常等三方面。炎性细胞浸润为硬皮病早期阶段的主要特征，以T淋巴细胞浸润为主，研究显示，T淋巴细胞可以释放多种细胞因子，引起炎症及血管病变，激活成纤维细胞及促进胶原纤维的合成[1]。目前，对于硬皮病主要以免疫抑制剂和对症治疗为主，但治疗效果并不理想，而且不良反应较多，需要寻找更为有效的治疗方法。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是来源于中胚层具有自我更新能力和多项分化潜能的成体干细胞，除了被应用于组织修复和再生医学领域外，由于其低免疫原性和强有力的免疫调节性，在自身免疫性疾病的治疗方面也备受青睐。研究显示，静脉注射 MSCs 可以降低关节炎小鼠的发病率及缓解其关节炎症状[2]；此外，MSCs 还可以减少狼疮小鼠血清中抗双链 DNA 抗体和蛋白尿的生成[3]，这为 MSCs 治疗硬皮病提供了可能。在MSCs众多来源中，脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)由于其易于获得、提取和扩增，被广泛应用于自身免疫疾病的研究和治疗中，因此本实验采用 ADSCs 治疗博来霉素(bleomycin,BLM) 诱导的硬皮病小鼠，观察其治疗效果，探讨 ADSCs 可能的免疫调节机制。

1 资料与方法

1.1 实验材料

实验动物：SPF 级6～8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠，购于上海轩研生物科技有限公司。

试剂及仪器：达尔伯克氏改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle medium nutrient medium F-12，DMEM/F12 )购自美国Gibco公司，澳洲源优级胎牛血清(fetal bovine serum,FBS )购自美国Gibco公司，磷酸缓冲液(phosphate buffer saline,PBS )购自美国Gibco公司， 反转录试剂盒 RR037A、裂解液(Trizol )试剂、荧光定量试剂盒 DR041A购自日本Takara公司，白介素(interleukin,IL)-6 和 转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA) 试剂盒购自中国新启迪公司，六孔板购自丹麦Nunc公司，细胞培养箱购自日本SANYO公司，荧光定量PCR 仪购自中国BIOER公司，倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS公司，流式细胞仪购自美国BD公司，离心机购自美国Thermo Fisher SCIENTIFIC公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6J 小鼠ADSCs的分离纯化

取 6～8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠 10只，脱颈处死，75%(体积分数)乙醇消毒 5 min，取腹股沟部 1 g 脂肪组织，PBS缓冲液冲洗 3 次，剪成 1 mm3小块，置于 0.4%(质量分数)Ⅰ型胶原酶中，在 37 ℃恒温摇床中，200 r/min、消化 40 min；用 100 mm 细胞筛过滤，1 600 r/min 离心 5min，弃上清；分离的间充质干细胞在5 mL DMEM/F12+ 10% FBS+双抗的培养皿中培养，将细胞置37 ℃、 5%(体积分数) CO2培养箱中孵育，24 h后换液，待细胞汇合度达 90%时传代，传至第3代后进行储存，对第3代ADSCs进行表面标志物和多项分化能力的鉴定。

1.2.2 硬皮病小鼠模型建立及 ADSCs治疗

本实验选用 6～8 周龄 C57BL/6J 雌性小鼠24只， 将小鼠随机分为正常对照组、BLM 组、ADSCs(皮下)、ADSCs(静脉)，每组6只。正常对照组给予生理盐水 2 mL /(kg·d)皮下注射，其余3组给予博来霉素 2 mg/(kg·d)皮下注射，连续3周。3周造模成功后，分别采用皮下注射和尾静脉注射ADSCs(2×105个细胞)治疗，每4天1次，共3次。

1.2.3 标本的采集

小鼠治疗后1周内将各组小鼠脱颈处死，心脏取血并分离血清，血清保存于-20 ℃冰箱以备后用。取各组小鼠背部注射部位皮肤及肺组织，储存于-80 ℃冰箱，进行组织的冰冻切片HE染色。

1.2.4 小鼠脾淋巴细胞的提取及流式细胞术检测脾细胞中 TH17 和 Treg的 比率

将刚取出的小鼠脾在 100 nm 的细胞筛上用注射器内芯研磨，PBS缓冲液进行冲洗，收集细胞悬液，1 600 r/min 离心 5 min 弃上清，3 mL DMEM/F12+10% (体积分数)FBS 重悬细胞，加入 3 μL豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和 3 μL离子霉素(ionomycin) 刺激脾淋巴细胞，37 ℃、 5%CO2细胞培养箱内孵育 16 h，上机进行流式检测。

1.2.5 小鼠肺组织总RNA的提取及cDNA的反转录

用 Trizol 法提取小鼠肺组织中的总RNA，反转录试剂盒将RNA 反转录合成cDNA，实时荧光定量PCR法检测相关细胞因子mRNA的相对表达量，引物由上海生工生物有限公司合成。IL-6上游引物：5′-TGATGGATGCTACCAAACTGG-3′，下游引物：5′-TGGTCTTGGTCCTTAGCCACT-3′；TNF-α 上游引物： 5′-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3′ ，下游引物：5′-CATCTTCTCAAAATTCGAGTG ACAA-3′；IL-17 上游引物：5′-GGAAAGCTGGACCACCACA-3′，下游引物： 5′-CACACCCACCAG CATCTTCTC-3′ ；TGF-β上游引物: 5′-CAACACATCAGAGCTCCGAGAA-3′，下游引物: 5′-AAGGC GAAAGCCCTCAATTT-3′；内参对照β-actin 上游引物： 5′-ACCGTGAAAAGATGACCCAG-3′，下游引物:5′-AGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。反转录反应条件为 65 ℃ 5 min, 42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。 PCR 的反应条件: 95 ℃ 30 s,60 ℃ 1min, 72 ℃ 30 s, 40 个循环，以小鼠β-actin 作为内参对照，根据Ct值用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

1.2.6 ELISA检测小鼠血清中 IL-6 和 TGF-β的含量

取小鼠血清进行以下操作：(1)取已平衡至室温的板条，预留空白孔；(2)分别将标本或不同浓度小鼠标准品加入相应孔中，给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min；(3)洗板后加入生物素小鼠抗体工作液，封板，37 ℃孵育 60 min；(4)洗板后除空白孔外，加入酶结合物工作液，封板，37 ℃ 避光孵育30 min；(5)洗板后加入TMB 显色工作液，37 ℃避光孵育10 min；(6)加入终止液，混匀后即刻测量450 nm处的光密度值(optical density，D)。

1.2.7 组织病理形态分析

从-80 ℃冰箱中取出小鼠皮肤和肺组织，进行冰冻切片，切片厚5 mm，HE 染色观察肺组织炎性细胞浸润程度和肺泡结构的完整性，以及皮肤真皮层厚度、炎性细胞浸润及纤维化情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ADSCs 形态观察

ADSCs 在接种后 12 h 左右便有部分贴壁生长，48～72 h 汇合度达 80%，第3代细胞生长速度较快，细胞形态相对均一，以梭形为主，集落呈漩涡状(图 1)。

A, primary generation of ADSCs; B, first generation of ADSCs; C, second generation of ADSCs; D, third generation of ADSCs.

图1 脂肪间充质干细胞形态观察(×20)

Figure1 Morphological observation of ADSCs(×20)

2.2 ADSCs 对小鼠脾细胞中 TH17 及 Treg 所占比例的影响

流式细胞术结果显示：相比于正常对照组，BLM组 TH17及 Treg所占比例升高(P<0.05)，经ADSCs治疗后，TH17 细胞所占比例降低(P<0.05)，而 Treg 所占比例升高(P<0.05)，ADSCs(皮肤)组和 ADSCs(静脉)组之间差异无统计学意义(P>0.05，图2)

A, TH17 control group； B, TH17 BLM group； C, TH17 ADSCs(hypodermic injection)group； D, TH17 ADSCs(intravenous injection)group； E, Treg control group； F, Treg BLM group； G, Treg ADSCs(hypodermic injection)group； H, Treg ADSCs(intravenous injection)group.

图2 流式细胞术检测 TH17 和Treg 细胞所占比例

Figure2 Proportion of TH17 and Treg cell was analysis by flow cytometry

2.3 ADSCs 对 BLM 诱导的硬皮病小鼠肺组织中细胞因子基因表达的影响

实时荧光定量PCR 结果显示: BLM 组中 IL-17、IL-6、TNF-α的 mRNA 表达量较正常对照组升高(P<0.05)，而 TGF-β 的 mRNA 表达量较对照组无明显变化(P>0.05)；ADSCs 治疗后，IL-17、IL-6、TNF-α的 mRNA 表达量降低(P<0.05)，而 TGF-β 的表达量无明显变化(P>0.05)，ADSCs(皮下)组和 ADSCs(静脉)组之间差异无统计学意义(P>0.05，图 3)。

2.4 ADSCs 对 BLM 诱导的硬皮病小鼠血清中细胞因子的影响

ELISA 结果显示：BLM组较对照组 TGF-β、IL-6 的含量升高(P<0.05)，经 ADSCs 治疗后，IL-6 的含量降低(P<0.05)，TGF-β 的含量无明显变化(P>0.05)，ADSCs(皮下)和 ADSCs(静脉)组中 TGF-β、IL-6 的含量差异无统计学意义(P>0.05，图 4)。

2.5 ADSCs 治疗后小鼠皮肤组织病理学改变

HE染色结果显示：对照组皮肤组织结构正常，无炎性浸润和纤维化(图5A)；BLM 组皮肤真皮层增厚,有大量的胶原纤维积聚，皮肤附属器减少，有少量的炎性细胞浸润(图5B)；经 ADSCs 治疗后，皮肤真皮层明显变薄，胶原纤维积聚减少,可见正常的皮肤附属器(图5C、D)。

2.6 ADSCs 治疗后小鼠肺组织病理学改变

HE染色结果显示：对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，有少量的炎性细胞浸润(图6A)；BLM 组有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔断裂或消失(图6B)；经ADSCs 治疗后，ADSCs(皮下)组和 ADSCs(静脉)组的肺组织损伤情况有所改善，炎性细胞浸润减少(图6C、D)。

A, level of IL-17 in the lung tissue was detected by real-time PCR；B, level of TNF-α in the lung tissue was detected by real-time PCR；C, level of IL-6 in the lung tissue was detected by real-time PCR；D, level of TGF-β in the lung tissue was detected by real-time PCR.*P<0.05. ns, no statistical. H, hypodermic injection; I.V., intravenous injection.

图3 细胞因子 mRNA 的表达量

Figure3 mRNA expression of cytokines

A， level of IL-6 in the serum was detected by ELISA ； B， level of TGF-β in the serum was detected by ELISA. *P<0.05. ns, no statistical. H, hypodermic injection; IV., intravenous injection.

图4 血清中细胞因子的表示水平

Figure4 Cytokine expression in the serum

A,control group； B,BLM group； C, ADSCs(hypodermic injection)group；D, ADSCs(intravenous injection) group.

图5 小鼠皮肤组织病理学变化 (×40)

Figure5 Pathological changes in the skin of mice (×40)

A,control group； B, BLM group；C,ADSCs (hypodermic injection) group；D, ADSCs (intravenous injection) group.

图6 小鼠肺病理学变化 (×400)

Figure6 Pathological changes in the lung of mice (×400)

3 讨论

MSCs由于其强有力的免疫抑制能力被应用于自身免疫性疾病的治疗。体内外研究已经证实， MSCs可以通过与淋巴细胞的直接接触和分泌多种可溶性的细胞因子而发挥免疫抑制作用[4-5]；在移植物抗宿主病治疗中，MSCs也显示其免疫抑制能力[6]。ADSCs作为MSCs来源中的一种，同样具有MSCs的生物学特性，本实验旨在探讨 ADSCs对BLM诱导的硬皮病小鼠的治疗作用及其对T淋巴细胞亚群和多种细胞因子的免疫调节作用。

目前，MSCs免疫调节机制主要包括以下几方面：一方面，MSCs可以抑制丝裂原诱导的 T 细胞的活化[7]；另一方面，MSCs可以通过抑制细胞周期蛋白 D2 的表达，使 T 细胞停留在 G0/G1 期，从而抑制 T细胞的增殖和分化[8]；更重要的是，MSCs可以通过旁分泌释放多种可溶性的细胞因子和趋化因子，如TGF-β、吲哚胺 2，3 双加氧酶、血红素加氧酶-1、前列腺素 、趋化因子2等，这些细胞因子可以通过不同的途径抑制 T 细胞的增殖、分化。此外，研究发现，MSCs还可以抑制 IL-17、IL-6、 IL-22、TNF-α等多种细胞因子的分泌[9]。

免疫系统紊乱是硬皮病主要特征之一，涉及多种免疫细胞的异常，其中 TH17和 Treg与 硬皮病之间具有密切相关性。大量数据统计发现，硬皮病患者血清及受累脏器(如皮肤)中 TH17 和其所分泌的 IL-17 的含量显著升高，特别是在疾病的早期以及肺受累的情况下[10-11]；但对于调节性 T 细胞的含量增加与否还存在争议，这主要是由于硬皮病特殊的发病机制所致，在疾病早期炎症阶段会出现 Treg 细胞含量和功能的减低，随着病程进展，大量免疫细胞被激活，会分泌多种细胞因子(IL-1、IL-13、IL-17、TGF-β 等)，TGF-β 作为 Treg 细胞增殖和分化的重要诱导物，常会引起 Treg 细胞含量的增加[12]。本研究发现，BLM 诱导的硬皮病小鼠脾细胞中 TH17 和 Treg 细胞所占比例升高，血清中TGF-β的表达水平也明显升高，但肺组织中 TGF-β 的表达水平无明显变化；经 ADSC 治疗后，TH17所占比例明显降低，而 Treg 细胞所占比例升高，血清和肺组织中 TGF-β的表达水平无明显变化。结果表明，ADSCs可以抑制 TH17 细胞的增殖和分化， 同时促进Treg细胞的增殖和分化，但 ADSC(皮下)组与 ADSC(静脉)组之间无明显差异，TGF-β含量治疗后无明显变化，可能是由于细胞治疗时间较短导致。

在硬皮病发病和病程进展中有多种细胞因子参与，如IL-17、IL-6 、TNF-α、TGF-β 等，其中 IL-17、 IL-6 作为多效性细胞因子，不仅可以促进 T 细胞的增殖和分化，还与硬皮病的纤维化有关，近期研究发现[13]，TH7细胞所分泌的 IL-17A 可以激活成纤维细胞，促进胶原纤维的生成[14]，被动免疫注射抗 IL-6 受体的单克隆抗体可以改善硬皮病小鼠的纤维化症状[15]。本实验研究发现，经 BLM 诱导的硬皮病小鼠肺组织中 IL-17、 IL-6 、TNF-α及血清中 IL-6 的含量升高，经 ADSCs治疗后，明显降低，但 ADSCs(皮下)组与 ADSCs(静脉)组之间无明显差异。结果表明，ADSCs 可以抑制细胞因子 IL-17、IL-6、TNF-α的分泌，但不能表明皮下注射和静脉注射 ADSCs 之间有差异。

为了进一步阐明 ADSCs的治疗效果，本实验观察了BLM及ADSCs处理后小鼠肺和皮肤组织病理学改变，肺组织 HE 染色结果显示，BLM处理后，肺泡间隔断裂或消失，大量炎性细胞浸润。经ADSCs治疗后，肺组织炎性浸润明显减轻，可见部分正常的肺泡，结果表明，ADSCs可以减轻硬皮病小鼠肺的炎症，具有抗炎作用。皮肤组织HE染色结果显示，BLM处理后，皮肤真皮层增厚，有大量的胶原纤维积聚，皮肤附属器减少，皮下脂肪组织减少。经ADSCs治疗后，真皮层变薄，积聚的胶原纤维含量减少，可见为数较多的附属器及脂肪组织，结果表明，ADSCs可以缓解皮肤纤维化症状，可能是通过抑制 IL-6、IL-17 等促纤维化细胞因子的分泌，而发挥抗纤维化的作用。

本研究基于 ADSCs 的免疫调节能力，采用ADSCs治疗 BLM 诱导的硬皮病小鼠，观察ADSCs 对T淋巴细胞介导的免疫应答过程中相关免疫细胞和细胞因子的影响及其治疗的效果。实验表明，ADSCs 不仅可以抑制 TH17 的增殖、分化,以及减少炎性细胞因子 IL-17、IL-6 、TNF-α的分泌，同时，ADSCs还可以促进 Treg细胞的增殖和分化，从而有效抑制 T 细胞介导的免疫应答反应，有效抑制肺组织的炎性细胞浸润；此外，ADSCs可能通过抑制 IL-17、IL-6 等促纤维化细胞因子的分泌，达到抗纤维化的效果，从而改善硬皮病小鼠的皮肤纤维化，ADSCs 潜在的抗炎及抗纤维化功能为治疗硬皮病提供了有力的理论依据。

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(2016-08-11 收稿)

(本文编辑：刘淑萍)

Therapeutic effect of adipose tissue-derived stem cells on bleomycin-induced mice of scleroderma

DOU Jing-li1,2，BAI Li2，PANG Chun-yan2，ZHANG Wen-lan2，ZHANG Wei2，WANG Yong-fu1,2△

(1. Department of Rheumatology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, Inner Mongolia, China; 2. Key Laboratory of Autoimmunity of Inner Mongolia, Baotou 014010, Inner Mongolia, China)

Objective： To investigate the effects and mechanisms of adipose-derived stem cells (ADSCs) on bleomycin-induced mice of scleroderma. Methods: In the study, 24 C57BL/6J female mice were randomly divided into control group, bleomycin(BLM)group, ADSCs (hypodermic injection) group and ADSCs (intravenous injection) group . BLM [2 mg/(kg·d)] was injected into the mice to establish the model of scleroderma. There were 6 mice in each group .The control group mice were injected with normal saline 2 mL/(kg·d) by subcutaneously. The rest of the three groups were injected with BLM. ADSCs groups were injected with ADSCs (2×105) subcutaneously and intravenously, respectively. T-helper 17 (Th17 ) and regulatory T cell (Treg cell) of spleen cells were detected by flow cytometry. The levels of cytokines in the lung tissue and in the serum were detected by real-time fluorescence quantification. Real-time polymerase chain reaction(PCR) and enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA). The pathology change of skin and lung tissue was observed by hematoxylin eosin (HE)staining. Results: The proportion of Th17 and Treg increased in BLM group than in control group(15.30%±1.29%vs.4.32%±0.79%; 9.90%±1.95%vs.5.18%±1.35%,P<0.05), the expression of Th17 significantly decreased (5.02%±0.83%, 6.00%±0.82%vs.15.30%±1.29%,P<0.05) and the expression of Treg increased after the ADSCs therapy (14.32%±1.59%, 11.09%±4.31%vs. 9.90%±1.95%,P<0.05). The expression levels of IL-17，IL-6，tumor necrosis factor -α (TNF-α)mRNA in the lung tissue and IL-6 in the serum increased in BLM group than in control group [3.54±0.30, 10.65±0.66, 5.37±0.52vs. 1.00±0.00; (21.2±1.74) ng/Lvs. (16.87±1.09) ng/L,P<0.05]. The expression of these cytokines significant decreased after the ADSCs therapy [1.63±0.45,1.50±0.29vs.3.54±0.30; 3.11±0.85, 2.98±0.76vs.10.65±0.66;1.45±0.47, 1.59±0.41vs. 5.37±0.52; (17.87±1.45) ng/L, (17.61±1.16) ng/Lvs. (21.2±1.74) ng/L,P<0.05]. But there was no obvious difference between ADSCs (hypodermic injection) group and ADSCs (intravenous injection) group(P>0.05). The expression of TGF-β in the serum increased in BLM group than in control group[(33.95±2.49) ng/Lvs. (28.8± 2.29) ng/L,P<0.05], however, the expression of TGF-β mRNA had no significant differences than that of control group (1.17±0.11vs.1.00±0.00,P>0.05). The expression of TGF-β mRNA and protein had no significant differences than that of BLM group [1.25±0.11,1.26±0.12vs.1.17±0.11; (31.84±2.04) ng/L, (31.25±2.36) ng/Lvs. (33.95±2.49) ng/L,P>0.05]. HE staining showed that the inflammation of lung tissue was relieved and the dermal thickness and collagen deposition were decreased after the ADSCs therapy. Conclusion: ADSCs could effectively alleviate inflammation of the lungs and fibrosis of skin; the effects of anti-inflammatory and anti-fibrosis were associated with immune regulating function.

Stem cells, mesenchymal; Scleroderma； Immune regulation； Cytokines

国家自然科学基金项目(81360464)和内蒙古自然科学基金项目(2016MS08109)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China(81360464) and the Inner Mongolia Autonomous Region Natural Science Foundation Projects(2016MS08109)

时间：2016-10-31 16：04：17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161031.1604.004.html

R593.25

A

1671-167X(2016)06-0970-07

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.009

△ Corresponding author’s e-mail, wyf5168@ hotmail.com