小麦麸皮阿拉伯木聚糖体外益生活性研究

刘丽娅 赵梦丽 钟 葵 佟立涛 周闲容 王丽丽 刘兴训 蔺艳君 张梅红 周素梅

(农业部农产品加工综合性重点实验室 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

小麦麸皮阿拉伯木聚糖体外益生活性研究

刘丽娅 赵梦丽 钟 葵 佟立涛 周闲容 王丽丽 刘兴训 蔺艳君 张梅红 周素梅

(农业部农产品加工综合性重点实验室 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

通过体外发酵培养的方法，比较了碱提阿拉伯木聚糖(AX)及其酶法(AXEM1、AXEM2)和酸法(AXC1、AXC2)降解产物的体外益生活性。结果表明，碱提AX及其酶法和酸法降解产物均能促进双歧杆菌增殖，与葡萄糖相比，log值增加0.98～1.27个数量级；酶解样品AXEM1对乳酸杆菌的增殖效果最好，阳性对照菊粉及其他AX样品及均不能促进乳酸菌生长。AX及其降解产物益生活性分数均大于0，表明AX及其降解产物均具有一定的益生活性；其中益生活性值最高的为AXEM2，益生活性分数达到0.35，高于阳性对照菊粉。采用离子色谱测定发酵液短链脂肪酸组成及含量发现，AXEM1组发酵液中总短链脂肪酸含量最高，约41.02 μmol/mL。丁酸作为益生元活性的重要指示性指标，仅在酶解样品AXEM2中检出，含量为0.05 μmol/mL，与AXEM2样品益生活性分数最高的结果一致。

小麦麸皮 阿拉伯木聚糖 益生活性 短链脂肪酸

人类每天都要消耗大量的非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides, NSP)，这些碳水化合物中许多都不能被小肠消化，但能够为寄居在大肠中的某些细菌提供发酵碳源。阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan, AX)是小麦麸皮中一种重要的非淀粉多糖。近年来，AX对肠道微生态的调节作用受到关注。研究发现，AX及其水解产物阿拉伯木寡糖(Arabinoxylan oligosaccharide, AXOS)可以促进动物和人肠道双歧杆菌、乳杆菌等益生菌的生长[1]。益生元(prebiotics)的概念最早由Gibson于1995年提出[2]，2008年由国际益生元/益生菌联合会(ISAPP)修订为：一种选择性的对肠道微生物的组成或活性产生特殊改变并有益于机体的发酵产物。益生元对机体的有益作用主要表现为：稳定肠道微生物的组成，促进肠道功能，降低肠道感染性疾病的发生；增加矿物质吸收和促进骨健康；调节免疫功能；降低肠癌、肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生等。

体外发酵技术被广泛用于研究多种基质的益生元功能特性，定量公式的应用促进了不同基质的益生元功能研究。Palframan等[3]首次提出采用PI值(Prebiotic index, PI)来评价。B/E值表示肠道内双歧杆菌和肠杆菌数量log值的比值[4]。Huebner等[5]提出了另一个益生元功能评价的指标——益生元活性分数(Prebiotic activity score)。这些评价指标都是基于在体外发酵过程中主要菌群数量的变化，将数值带入公式，计算最终结果。数值越大，益生效果越好。非淀粉多糖经肠道微生物代谢的终极产物是短链脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFA)[6]，如乙酸、丙酸、丁酸等。短链脂肪酸能够为肠道菌及宿主提供营养和能量，且被证实具有多种生理功能。

本实验室前期已通过碱提法获得了较高纯度的AX样品，并在此基础上通过酶法和酸水解的方式获得具有不同分子质量组成和分布特点的AX降解产物。本研究进一步通过体外发酵的方式研究不同方法制备的AX样品对肠道双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌生长及代谢产物短链脂肪酸(SCFA)的影响，并采用益生元活性分数评价了AX样品的益生效果，为进一步研究AX的益生活性及机制提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室自制碱提阿拉伯木聚糖产品AX，酶解阿拉伯木聚糖产品(AXEM1、AXEM2)，柠檬酸酸解阿拉伯木聚糖产品(AXC1、AXC2)，制备方法参照文献[7]；乳酸、乙酸、丙酸、丁酸均为色谱纯：美国Sigma公司；厌氧产气袋：日本三菱公司。

1.2 仪器与设备

ICS-3000型离子色谱仪：美国戴安公司；MCO-15AC型CO2培养箱：日本三菱公司；BSD-150型全温振荡培养箱：北京东南仪器实验室设备有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F型洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵培养基配制

发酵培养基配制(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨2， K2HPO40.04，KH2PO40.04，NaCl 0.1，CaCl2·H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.01，NaHCO32，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，胆汁酸盐0.5，氯化血红素0.005；吐温-80 2 mL/L，维生素K110 μL/L[8]。注：氯化血红素需配制1 mol/L NaOH去溶解，每次滴加3滴,滴加2次，溶解后蒸馏水冲洗转移至发酵培养基。待所有试剂全部溶解，用1 mol/L 盐酸调节pH为7.0。

1.3.2 体外发酵培养

以健康成人(年龄为20～28岁)的粪便作为发酵菌种。试验对象1个月内未服用抗生素，且无肠胃病史。粪样收集于密闭的粪便储存盒里，冷冻保存。

新鲜粪样，悬浮于冰冷0.1 mol/L pH 7.3 PBS缓冲液中(缓冲液提前灭菌)，使粪样质量浓度为50mg/mL(10 g粪便样品溶于200 mLPBS)，加无菌玻璃珠蜗旋1 min，静置取上清液。

发酵基础培养基(未加葡萄糖)，对照组1添加1%葡萄糖，2添加1%菊粉，试验组1～5分别添加1%(以纯品计)的碱提阿拉伯木聚糖AX、酶解阿拉伯木聚糖AXEM1、AXEM2，酸解阿拉伯木聚糖AXC1、AXC2。每个样品定容250 mL。每组设两个重复。加塞并插上针头，115 ℃灭菌15 min。灭菌后拔出针头。冷却后在点燃酒精灯情况下，用无菌注射器加入1%粪悬液至发酵培养基，混匀。37 ℃发酵培养，分别在0、6、12、18、24 h，取1 mL发酵液接种到9 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液中，连续梯度稀释，接种到选择性培养基培养计数。测定双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌数量及各发酵液pH值。并对24 h取样测定短链脂肪酸组成及含量。

1.3.3 测定肠道菌的选择性培养条件

测定肠道菌的选择性培养条件[9]，如表1所示。

表1 定肠道菌的选择性培养条件

1.3.4 益生活性分数计算

益生活性分数计算参照参考文献[5]。

益生活性分数=[(log 24 h益生元培养基中益生菌数-log 0 h益生元培养基中益生菌数)/(log 24 h葡萄糖培养基中益生菌数-log 0 h葡萄糖培养基中益生菌数)]-[(log 24 h益生元培养基中肠道菌数-log 0 h益生元培养基中肠道菌数)/(log 24 h葡萄糖培养基中益生菌数-log 0 h葡萄糖培养基中益生菌数)]

式中：益生菌以乳酸杆菌和双歧杆菌计，肠道菌以大肠杆菌计。

1.3.5 发酵液pH测定

取固定时间的发酵液，冷却至室温，用酸度计测定pH值，每个样品测定3次，以平均值计。

1.3.6 短链脂肪酸的测定

采用离子交换色谱测定短链脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFA)组成。发酵液适度稀释，采用0.22 μm滤膜过滤，滤液备用。进样量20 μL，检测温度30 ℃，洗脱液流速为1.0 mL/min。洗脱程序为：采用 0.08 mmol/L KOH等度洗脱24 min，最终洗脱液中KOH浓度0.08 mmol/L。配制乳酸、乙酸、丙酸、丁酸混标绘制标准曲线。

1.4 统计分析

采用Microsoft Excel进行数据整理，用SAS9.2软件进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 不同阿拉伯木聚糖样品分子质量分析

按照文献[7]建立的AX碱法提取及降解的相关方法，选取的5种AX多糖样品的分子量测定结果见表2。数据表明，实验室碱提AX样品主要组分分子质量(Mw)为2.964×105u，该多糖样品经戊聚糖酶降解、再经60%的乙醇分级沉淀后得到的产物AXEM1中仍含有较高比例(44.76%)分子质量大于105u的组分；而采用80%乙醇分级沉淀得到的AXEM2分子质量大幅度降低，主要组分分子质量集中在5.227×104u。柠檬酸作为一种弱酸，能明显降低AX分子质量，AXC2样品(0.15 mol/L柠檬酸、95 ℃下作用2 h )主要组分分子质量降低至1 000 u。

表2 阿拉伯木聚糖样品分子量分布

2.2 发酵液pH变化情况

发酵过程中，分别在0、6、12、18、24 h取不同样品组发酵液，测定pH值。由表3知，发酵液初始pH值均有所升高。随着发酵时间的延长，pH均呈现下降趋势。其中，葡萄糖培养基pH下降最快，降至4.63。相对较低的为AXEM2和AXC1发酵液(最低pH值分别为5.06和5.11)。发酵液pH的下降，与多糖在代谢过程中被双歧杆菌等利用产生乙酸等短链脂肪酸有关[9]。也有研究报道，随菌密度的增加，培养基pH也会不断下降[10]。

表3 样品发酵液pH的变化

2.3 发酵液主要肠道菌群变化研究

不同实验组发酵液中主要肠道菌数量统计如表4所示。所有阿拉伯木聚糖样品及菊粉均能促进双歧杆菌的增殖。与葡萄糖组相比，log值增加0.98～1.27个数量级。AX、AXEM1、AXEM2分子质量依次减小，与AX相比，AXEM1对应发酵液中24 h双歧杆菌数量无显著差异，AXEM2则显著增大(9.04 log cfu/mL发酵液)；AX经柠檬酸酸解所得样品AXC1、AXC2分子质量有所降低，但AXC1对双歧杆菌的益生效果比AX差，AXC2则无显著差异，这可能是由于酸解破坏了某些活性基团。其中AXEM2对双歧杆菌的增殖效果与菊粉效果相当。Napolitano等[11]将小麦水不溶性阿拉伯木聚糖酶解成为水溶性阿拉伯木聚糖后，模拟人体肠道微生物环境分别对其进行体外发酵培养。结果发现，与水不溶性阿拉伯木聚糖相比，酶解后的样品更快地促进了益生菌的生长。这也证实了对碱提阿拉伯木聚糖的适度酶解，可以提高其益生活性。另外，葡萄糖组，乳酸杆菌数量也有所增加。不同阿拉伯木聚糖样品中，AXEM1对乳酸杆菌的增殖效果最显著，其他均低于葡萄糖组。不同分子质量AX对乳酸杆菌的增殖，无明显规律性。Rycroft 等[12]通过研究几种商品益生元益生功能，发现几乎所有益生元都能有效促进双歧杆菌的增殖，但对于乳酸杆菌的增殖效果，却存在不确定性，并非所有益生元均能引起乳酸杆菌的显著增殖。

2.4 阿拉伯木聚糖益生元功能评价

采用益生活性分数计算法对菊粉及阿拉伯木聚糖样品的益生活性进行了评价，结果如图1所示，菊粉和阿拉伯木聚糖的益生活性分数均大于0，说明阿拉伯木聚糖与菊粉一样，具有益生活性，益生活性值最高的为AXEM2，分数为0.35，超过菊粉。从益生活性值可以看出，阿拉伯木聚糖的益生活性可与菊粉相媲美。且多糖降解程度越高，益生活性越好。这与已有相关文献报道一致[11]。对比酶解样品与酸解样品，虽然酸解样品AXC1和AXC2分子质量小于酶解样品AXEM2，但益生效果不如酶解样品好。这可能是因为酸解对阿拉伯木聚糖的功能活性基团有一定的破坏作用。

图1 益生元活性值

表4 不同碳源发酵液中主要肠道菌数量统计

菌种时间/h葡萄糖菊粉AXAXEM1AXEM2AXC1AXC2双歧杆菌127.69±0.04d8.95±0.04ab8.85±0.06bc8.99±0.08a9.00±0.03a8.74±0.04c8.84±0.01bc247.78±0.03d9.05±0.03a8.94±0.02b8.96±0.03b9.04±0.02a8.76±0.02c8.96±0.01b乳酸杆菌127.00±0.01e6.88±0.01f6.54±0.04g7.91±0.02a7.78±0.02b7.28±0.02d7.63±0.01c248.43±0.01b8.42±0.05b8.18±0.01e8.53±0.01a8.26±0.01d8.27±0.01d8.33±0.01c大肠杆菌127.33±0.01e7.49±0.02a7.35±0.01d7.35±0.01d7.43±0.01b7.31±0.01f7.38±0.01c247.57±0.11abc7.71±0.02a7.46±0.01d7.63±0.01ab7.49±0.03bc7.52±0.01bc7.61±0.04abc

注：单位：log cfu/mL发酵液，同行中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表5 24 h不同碳源样品发酵液中SCFA含量统计

注：单位μmol/mL，总SFCA=乳酸+乙酸+丙酸+丁酸，“—”表示未检出，同行中不同小写字母表示差异显著(P<0.05 )。

2.5 发酵液短链脂肪酸测定结果

短链脂肪酸(SCFA)对机体具有重要的生理功能。谭力等[13]认为盲襻综合征大鼠血浆SCFA水平明显升高，能较好地反映肠道菌群的增殖程度，从而达到调节肠道正常菌群平衡的目的。生物体内的SCFA主要包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。其中丁酸是结肠细胞的主要能源物质，能够维持结肠黏膜的完整性，对于抵御癌症和溃疡性结肠炎等疾病等起着至关重要的作用；而乙酸、丙酸经结肠吸收后成为肝脏用以合成葡萄糖的底物。此外，丙酸、丁酸对调节细胞增殖和分化起主要作用。阿拉伯木聚糖作为肠道细菌发酵底物，主要被双歧杆菌和乳酸杆菌利用产生SCFA，从而使结肠pH值降低。肠道的酸性环境具有较强的抑菌作用，能够控制病原菌的生长和繁殖，并有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长[14]。本试验测得24 h时，总短链脂肪酸含量最高的为AXEM1组。这主要是因为该组乙酸含量较高，分别为(34.37±0.61)、(23.17±0.03)μmol/mL，文献[15]报道乳酸杆菌发酵提取物中乙酸含量最高。除AXEM2样品外，其他样品均未检出丁酸。刘小华等[16]研究证实丁酸在毫摩尔浓度下就能发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和凋亡作用。丁酸是益生元活性的重要指示性指标，这与AXEM2样品益生活性分数最高相符。菊粉样品丙酸含量最高，但却与其他大多数阿拉伯木聚糖样品一样，未检出丁酸。

近年来，有关肠道菌群调节功能的研究多以低聚糖为主，主要集中在低聚木糖、低聚异麦芽糖等低聚糖的研究。聚合度相对较高的大分子多糖调节肠道菌群的报道则较少。在人体肠道中，低聚糖的发酵主要位于结肠近端，通过代谢产生短链脂肪酸，从而使pH值下降。阿拉伯木聚糖的溶解度、聚合度、取代度A/X、侧链的分布以及阿魏酸发生交联的程度均能对其益生活性产生影响，这是研究其构效关系的主要因素。Grotaert等[17]研究发现，阿拉伯木聚糖的结构多样性、高聚合度以及肠道菌群中相关水解酶的代谢抑制作用使得阿拉伯木聚糖的发酵部位发生在结肠更远端，成为慢发酵型潜在益生元。它们在结肠远端可作为产生SCFA的碳源，也可以抑制脂类和蛋白质代谢产生有害物质，从而降低了结肠癌发生的风险。深入开展阿拉伯木聚糖的肠道菌群调节功效研究将为小麦麸皮功能性多糖的有效利用和开发提供科学依据。

3 结论

所有AX样品均能促进双歧杆菌的增殖，与葡萄糖组相比，log值增加0.98～1.27个数量级。不同样品中，AXEM1对乳酸杆菌的增殖效果最显著，其他均低于葡萄糖组。菊粉和所有样品益生活性分数均大于0，说明阿拉伯木聚糖与菊粉一样，均具有益生活性，益生活性值最高的为AXEM2，分数为0.35。并且降解程度越高的，益生活性较好。采用离子色谱测定发酵液短链脂肪酸组成，标准品与发酵液样品中SCFA分离效果良好，不存在拖尾现象。试验结果，发酵液中总短链脂肪酸最多的为AXEM1培养基。除AXEM2样品外，其他均未检出丁酸。丁酸是益生元活性的重要指示性指标，这与AXEM2样品益生活性分数最高相符。菊粉样品虽丙酸含量最高，但却与其他大多数阿拉伯木聚糖样品一样，未检出丁酸。

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In Vitro Prebiotic Activity of Arabinoxylan from Wheat Bran

Liu Liya Zhao Mengli Zhong Kui Tong Litao Zhou Xianrong Wang LiliLiu Xingxun LinYanjun Zhang Meihong Zhou Sumei

(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture; Institute of FoodScience & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

Invitrofermentation method was used to evaluate the prebiotic activity of arabinoxylan with alkali extraction (AX) and its degradation products with enzyme (AXEM1, AXEM2) and acid (AXC1, AXC2). The results showed that all arabinoxylan samples could promote the proliferation of bifidobacteria and the log value of bifidobacteria increased from 0.98 to 1.27 magnitude compared with glucose. AXEM1had a better effect on the proliferation of lactobacilli. Inulin, the positive control and other AX samples could not promote the growth of lactobacillus. The prebiotic activity scores of arabinoxylan samples were higher than 0, which indicated that they all had prebiotic activity. And AXEM2sample showed the highest score 0.35, which was higher than the score of inulin. Short-chain fatty acids (SCFA) detected by ion Chromatography showed that the total SCFA contents of AXEM1was the highest, which was about 41.02 μmol/mL. Butyrate, as an important indicative target of prebiotic activity was only detected in AXEM2group with the content of 0.05 μmol/mL, which was consistent with the result that the highest prebiotic activity score was obtained in AXEM2group.

wheat bran, arabinoxylan, prebiotic activity, short-chain fatty acids

TS210.9

A

1003-0174(2016)10-0001-06

国家自然科学基金(31271852)，国家国际科技合作专项(2012DFA31400)

2015-01-20

刘丽娅，女，1982年出生，副研究员，粮油加工与功能食品

周素梅，女，1971年出生，研究员，粮油加工与功能食品