维甲酸诱导成釉细胞瘤细胞分化的研究*

雷印涛 王旭霞 孙 钢

(1.泰山医学院附属医院口腔科，山东 泰安 271000； 2.山东大学口腔医学院口腔颌面外科，山东 济南 250012；3.浙江大学医学院附属第二医院口腔颌面外科，浙江 杭州 310009)



维甲酸诱导成釉细胞瘤细胞分化的研究*

雷印涛1王旭霞2孙 钢3

(1.泰山医学院附属医院口腔科，山东 泰安 271000； 2.山东大学口腔医学院口腔颌面外科，山东 济南 250012；3.浙江大学医学院附属第二医院口腔颌面外科，浙江 杭州 310009)

目的 探讨全反式维甲酸对成釉细胞瘤细胞分化的影响。方法 实验采用10-4M，10-5M，10-6M三种浓度梯度的全反式维甲酸对原代培养的成釉细胞瘤细胞进行48小时，4天，5天，7天四个阶段的体外诱导实验。利用MTT，流式细胞术和透射电镜技术对细胞的增殖，细胞周期和凋亡的改变进行检测。结果 发现ATRA10-6M组作用5天效果最好，增殖抑制率31%，细胞S期减少13%，提高了静止期细胞数，凋亡指数由初始细胞的8.7%升高到39.3%，细胞形态也发生相应变化。结论 维甲酸可能促进成釉细胞瘤细胞诱导分化的作用。

全反式维甲酸；成釉细胞瘤；分化

成釉细胞瘤作为最常见的牙源性肿瘤,具有局部浸润性生长等恶性肿瘤的特征，属临界肿瘤，但罕见转移，多见于青壮年，目前主要治疗手段是外科治疗，手术切除后复发率较高，这与其生长方式有关，为了减少复发，常常需要扩大切除范围，给患者的容貌和口腔功能造成很大的破坏。因此有必要从其发生发展的分子生物学基础上进行深入研究，认识疾病机制，探索新的有效防治方法。维甲酸具有调节上皮细胞生长、分化的功能，通过细胞核内DNA结合蛋白调节有关基因的表达而发挥其生物学效应。临床上常用于粘膜、皮肤病的治疗。国内外学者应用其进行了大量的细胞诱导分化实验，包含干细胞、神经细胞、上皮细胞、成骨细胞，以及牙周膜细胞、成纤维细胞和成釉细胞等诸多方面，取得了满意的效果[1-4]。成釉细胞瘤细胞是上皮细胞，类似于幼稚的未成熟的前成釉细胞和星网状层细胞，分化水平保持在牙胚发育的帽状期/钟状期，具备向正常细胞转化的潜能。本实验应用全反式维甲酸诱导成釉细胞瘤分化，检测其生物学性状的变化。

1 材料与方法

1.1 原代培养成釉细胞瘤细胞，选取第二代细胞

1.1.1 在超净工作台内将取材标本在双抗瓶中取出，放入无血清的培养基中5 min，将组织块剪成小块，直至成0.5 mm2大小为止。加入4.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，加0.5 mlⅠ型胶原酶(2000 u/ml)，盖好橡胶塞，放在37 ℃水浴中消化4 h，用吸管反复吹打，使大部分组织块自然下沉，然后将细胞悬液移入消毒的离心管中，离心1000 r/min 8 min，吸去上清，加入6 ml DMEM培养基，吹打混匀，取样计数。

1.1.2 接种培养 用Ⅰ型胶原铺底的25 ml培养瓶接种1 ml细胞悬液，加4 ml 培养液，盖紧瓶塞，放入37 ℃ 5% CO2恒温恒湿箱中孵育。培养3天后观察，5天换液，以后每隔3天换一次培养液，同时每天观察细胞形态，有无污染。

1.1.3 细胞传代培养 加入5滴0.25%胰蛋白酶，转动培养瓶，使其侵过整个瓶底，室温下放置3 min，反转瓶子，观看细胞单层，如出现小孔状间隙，再消化1 min。加入3 ml培养液中止消化，用吸管吸取培养液反复冲击瓶底的细胞层，直至细胞全部被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液，然后吸取1 ml悬液加入新的25 ml培养瓶中。原瓶留下1 ml细胞悬液，并向每个瓶中加培养液5 ml，盖好瓶塞，放入37 ℃恒温箱中孵育。

1.1.4 光镜下观察，免疫组化研究(免疫组织化学SABC法)进行角蛋白CK-18,CK-19、波形蛋白、bcl-2抗体的免疫组化实验。

1.2 诱导分化后的形态学观察 用含体积分数为0.1%的无水乙醇的DMEM对照液将全反式维甲酸(ATRA)稀释成10-4，10-5，10-6mol/L(M)浓度后，加入已培养24 h的细胞培养液中，分别于48 h、4天，5天，7天，在倒置相差显微镜下观察实验组和对照组肿瘤细胞的形态变化。

1.3 MTT法检测细胞抑制率

1.3.1 实验组分别加入终浓度10-4、10-5、10-6mol/L三种不同浓度去全反式维甲酸。对照组加入DMEM(含体积分数为0.1%的无水乙醇)。加药后2、4、5、7 天各取一板,每孔加入(5 mg/ml)的四甲基偶氮唑盐(MTT)20 μl, 150 μl的二甲亚砜(DMSO) 。酶联免疫检测仪检测，波长为570 nm，测定各孔光吸收值，记录结果。

1.3.2 统计学检验 应用SPSS18.0统计分析软件，计量资料描述用均数±标准差表示，以方差分析进行统计分析，P≤0.05具有统计学意义。

1.4 流式细胞仪检测 根据MTT检测结果，选择最高和最低浓度组进行流式细胞仪检测。第二代细胞的培养瓶中加入终浓度10-4M、10-6M两种不同浓度全反式维甲酸，对照组加入DMEM(含体积分数为0.1 %的无水乙醇)。收集维甲酸处理5天的成釉细胞瘤细胞，加1 ml 50 mg/ml碘化丙碇(PI)综合染液。在4 ℃ DNA染色20 min,离心，在Elite ESP型流式细胞仪(Coulter公司)上检测，激光光源为氩离子激光，波长488 nm，检测前以标准微球液核准仪器使其变异系数(CV)<2%，测出各标本DNA含量，以G0/G1前期亚2倍峰为凋亡峰，通过FCM-Elite随机软件进行分析计算出各值。

1.5 透射电镜观察 根据维甲酸对成釉细胞瘤细胞诱导的MTT法和FCM检测结果，选择作用效果最好的维甲酸浓度10-6M组为实验组，作用瘤细胞5天，收集同期对照组和药物处理后的细胞。日立H-600IV型透射电镜观察、照像。

2 结 果

2.1 病理结果 肉眼见标本约7 cm×9 cm大小，位于下颌角和升支，浸润骨组织，骨吸收明显，肿瘤表面包膜不完整，剖面有囊性和实性混合存在，实性区灰白色，取实性区。切片HE染色光镜下见肿瘤上皮形成多个上皮岛，中心由多边或多角形细胞构成，细胞间疏松连接，有囊液，周边围绕柱状和立方状细胞，细胞栅栏状排列，核极性倒置，岛间夹杂一些中间层和成纤维细胞，有玻璃样变(图1)。

图1 滤泡型成釉细胞瘤病理切片(HE)由类似牙囊的肿瘤细胞岛组成，岛中央囊性变

2.2 原代培养细胞生长特点

2.2.1 第一代成釉细胞瘤细胞形态 原代培养8天后，成釉细胞瘤细胞围绕组织块呈铺路石子样紧密排列，形态多边形(图2)。

图2 第一代AM细胞形态 200×

2.2.2 第二代细胞形态 第一代培养1周后，成釉细胞瘤细胞布满瓶底90%左右,形态正常，进行消化传代，一传二。肿瘤细胞出现少量小的多角细胞，有些散在分布在簇外，形态稍长，多边形，胞核大，有少量细胞出现空泡性变，主要在簇中位置，悬浮的死亡细胞稍增多，成纤维细胞也开始增多(图3)。

图3 AM细胞第二代形态 200×

2.3 免疫组化结果 先用HE染色定位细胞，瘤细胞成簇生长，周围有散在分布的少量成纤维细胞(图4)。成釉细胞瘤细胞属于上皮细胞，镜下示扁平多角形，对上皮特异性抗体角蛋白18、19表达阳性，在胞浆染色黄色，胞核不着色(图5，6)。波形蛋白主要是间叶组织抗体，肿瘤细胞不染色，表达阴性(图7)。在肿瘤细胞周围存在的成纤维细胞是间质细胞，染色正好相反，角蛋白抗体染色阴性，而波形蛋白抗体染色呈阳性。Bcl-2抗体是凋亡抗体，表达阳性(图8)。

图4 HE染色定位细胞 200×

图5 角蛋白18染色阳性 200×

图6 角蛋白19染色阳性 200×

图7 波形蛋白染色阴性 200×

图8 bcl-2染色阳性 200×

2.4 MTT结果 成釉细胞瘤细胞生长慢，3种浓度维甲酸处理48 h细胞生长抑制率变化不明显，浓度组间差异明显，10-6M抑制效果最好，而10-4M组效果最差。随时间延长，抑制率逐渐提高，在作用5天后，抑制作用达到最高峰，各组都有显著提高，仍是10-6M浓度组抑制效果最好，成釉细胞瘤细胞生长减慢，主要是坏死细胞增多，细胞量减少。形态由立方形向长星形转化，用药组转化慢。第7天抑制率又明显下降，各组间差别不显著。见表1～4。

表1 ATRA对AM细胞诱导作用48 h的OD值及抑制率

表2 ATRA对AM细胞诱导作用4天的OD值及抑制率

表3 ATRA对AM细胞诱导作用5天的OD值及抑制率

表4 ATRA对AM细胞诱导作用7天的OD值及抑制率

2.5 流式细胞仪检测结果 根据MTT结果，我们发现在维甲酸诱导第5天，增殖抑制效果最好，其中又以10-6M组效果最佳，而10-4M组效果最差。我们选取维甲酸效果最好与最差两个浓度组细胞，即10-6M和10-4M，作为实验组，添加0.1%无水乙醇的成釉细胞瘤细胞作为对照组，诱导第5天进行流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。发现10-6M组细胞S期和G2/M期细胞数都减少，相应G1期细胞数增多。10-4M组变化不明显，和对照组没有差异。见表5。

2.6 超微结构观察 在透射电镜下观察，成釉细胞瘤细胞核较大，不规则，有深核沟，核内以常染色质为主，胞浆内核糖体、粗面内质网丰富，胞浆内见少量微丝，糖原丰富。经过维甲酸诱导后细胞核膜完整，核呈椭圆形，线粒体清楚，结构好，糖原少，微丝多，粗面内质网扩张，形态向正常细胞转化。见图12,13。

表5 ATRA对AM细胞诱导作用5天的SPF值及PI

三组的凋亡指数AI有明显差异，10-6M组最高为39.3%，10-4M组为10.7%，而对照组最低为8.7%。见图9～11。

图9 对照组细胞凋亡指数8.7%

图10 10-4M组细胞凋亡指数10.7%

图11 10-6M组细胞凋亡指数为39.3%

图12 透射电镜观察AM细胞细胞核较大，不规则，有深核沟，核糖体、粗面内质网丰富，微丝少，糖原丰富。

图13 透射电镜观察经维甲酸处理的AM细胞，核膜完整，核呈椭圆形的，线粒体结构好，微丝多，糖原少，粗面内质网扩张。

3 讨 论

维甲酸(ratinoic acid，RA)是维主素A的衍生物，通过细胞核上不同受体产生包括细抱分化、代谢等多种生物学效应。维甲酸系统具有大量不同的靶基因，发挥转录和非转录等多种作用。维甲酸受体可以分为两大类：维甲酸受体(RAR)和维甲类X受体(RXR)，都属于核受体超家族。正常情况下，RAR和RXR形成异二聚体，与靶基因启动子部位的特定序列-维甲酸反应元件特异地结合而发挥功能[5]。维甲酸与RARα结合，改变其构象，导致共抑制因子复合物从RARα上解离，使共激活因子与其结合，激活转录。由此转录合成的一些调节蛋白又可以激活下游的基因表达，这样就形成一个连锁反应，最后维甲酸介导的信号就被传递到庞大的信息网络中，产生极其多样化的生物学效应[6]。1987年我国首次报导应用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)获得成功，在肿瘤领域掀起了研究其机制的高潮。维甲酸在胚胎发育、细胞分化、内环境稳定中发挥多种作用。维甲酸具有不同的生物效应，可以调整成骨细胞的增殖、牙周膜细胞分化为成牙骨质细胞和成骨细胞形成矿化组织。研究[7]表明，维甲酸类化合物可能通过调节蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶A(PKA)途径，影响细胞内信号传导系统，进而影响细胞内mRNA和蛋白质的合成，在诱导肿瘤细胞向正常细胞分化中发挥作用。

通过MTT实验发现，维甲酸针对成釉细胞瘤(AM)细胞，可以使其增殖减弱，抑制增殖作用在第5天最强，三个浓度梯度组中，尤以10-6M组最明显，达到31%，10-4M组作用最弱。我们继而选择这两个浓度梯度组进行下一步流式细胞仪(FCM)的检测，发现维甲酸诱导成釉细胞瘤5天后，细胞周期改变，静止期细胞增多，合成期及分裂期细胞减少，改变幅度不大，平均降低15%左右，这可能与AM细胞增殖活力不强有关。更重要的是凋亡细胞数明显增加，促进了肿瘤细胞的凋亡，经过诱导后肿瘤细胞的凋亡率从8.7%升到39.3%，作用非常显著。AM细胞浸润生长特性与抑制凋亡有关，通过抑制凋亡有可能会改变成釉细胞生长特性。实验证实维甲酸的不同浓度产生不同的效应，10-6M浓度产生的诱导作用最强，增加浓度反而降低了效应。另外还与作用时间有关，诱导48 h没有产生明显效果，5天效果最好，以后就逐渐减弱，这与药物效力和肿瘤细胞对其耐受有关。细胞分化主要表现在形态和功能两个方面。形态分化是细胞分化的表形特征, 也是最基本的特征,能客观地反应分化诱导剂对细胞的诱导分化作用。透射电镜观察发现成釉细胞瘤细胞核较大，不规则，有核沟，胞浆内核糖体、粗面内质网丰富，胞浆内见少量微丝，糖原丰富，表明瘤细胞活性大，蛋白合成旺盛。经过维甲酸诱导后细胞核膜完整，核呈椭圆形，线粒体清楚，结构好，糖原少，微丝多，粗面内质网扩张，形态向正常细胞转化，合成作用减弱，活性减低。

[1] Natsuko Shibuya, Eiji Nemoto, Sousuke Kanaya,et al.Retinoic acid is a potential negative regulator for differentiation of human perio-dontal ligament cells[J]. International Congress Series，2005,1284:217-218.

[2] Asma Hatoum, Marwan Eid El-Sabban, Joe houry,et al.Overex-pression of retinoic acid receptors alpha and gamma into neoplastic epidermal cells causes retinoic acid-induced growth arrest and apoptosis[J].Carcinogenesis，2001,22(12):1955-1963.

[3] Michaela Kneissel, Anne Studer, Reto Cortesi,et al Retinoidinduced bone thinning is caused by subperiosteal osteoclast activity in adult rodents[J]. Bone，2005,36: 202-214.

[4] 宋维铭，孙广慈，管正玉，等.维甲酸对成纤维细胞作用的体外观察[J].中华医学美容杂志，1998，4(4)：190-192.

[5] Huang D. Chen SW. Gudas LJ. Analysis of two distinct retinoic acid response elements in the homeobox gene Hoxb1 in transgenic mice[J]. Developmental Dynamics， 2002,223(3):353-370.

[6] 孙宇强,王雪,关兴芳, 等.维甲酸及其受体与肿瘤关系的研究进展[J].生命科学，2014，26(3):295-297.

[7] 洪凡青，陈飞虎，吴菲，等.新型维甲酸衍生物ATPR体外诱导消化系统肿瘤细胞分化的研究[J].肿瘤防治研究，2011,38(12):1375-1379.

Role of retinoic acid in the differentiation of ameloblastoma cells

LEI Yin-tao1WANG Xu-xia2SUN Gang3

(1.Affiliated Hospital of Taishan Medical University, Taian 271000, China;2.School of Stomatology, Shandong University,Jinan 250012,China;3.Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China)

Objective: To explore the affection of all-trans retinoic acid (ATRA) in progression and occurrence of the ameloblastoma. Methods： Primacy AM cells were cultivated. The cells' morphous and growth were observed, and detected with specific antibody. AM cell was induced by ATRA(10-4M,10-5M,10-6M)for two, four, five and seven days. By phase-contrast microscopy, transmission electron microscope, MTT, FCM and immunohistochemistry, the proliferation index, growth inhibittion ratio, cell cycle and apoptotic index were obtained. Results: AM cells in primary culture maintained epithelial cell morphology and expressed cytokeratins K18 and K19, but none expressed vimentin. Furthermore, bcl-2 protein, which prevented apoptosis, was expressed. AM cells underwent senescent within twenty-eight days. Time course and dose response had the effect on ATRA induced AM cells activity. Treated with 10-6M ATRA for five days, the effect on the differentiation of AM cell was the most significant. Proliferative activity of AM cell decreased and growth inhibition ratio was 31%. After being induced, the cell population of S stage was reduced and the cells of G0 stage were increased. Meanwhile, the apoptosis was obviously increased from 8.7% to 39.3%. Conclusion: ATRA can promote AM cells' morphological to be changed, and induce them differentiate to normal cell.

ATRA; ameloblastoma; induce

高等院校博士点新教师基金(20070335042)。

雷印涛(1969—)，男，副教授，主要从事口腔科教学和临床工作。

孙钢，E-mail：sungang531@163.com。

R782

A

1004-7115(2016)11-1205-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.11.002

2016-06-20)