丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的机制研究*

韩 平冯 俊陈华文

（1.湖北省秭归县人民医院，湖北 秭归 443600；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030）

·研究报告·

丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的机制研究*

韩 平1冯 俊2△陈华文2

（1.湖北省秭归县人民医院，湖北 秭归 443600；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030）

目的 探索丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的机制。方法 选取32只SD大鼠，按随机数字表法分为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA 40 mg组，每组8只。丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA 40 mg组分别于术前7 d开始给予20 mg/（kg·d）、40 mg/（kg·d）的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液腹腔注射。假手术组、缺血再灌注模型组均给予等量蒸馏水腹腔注射。采用结扎左前降支法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。各组于造模后3 h剪取心脏组织，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，Western bolt法检测p-Akt表达，免疫组化法检测Mfn2表达。结果 与假手术组相比较，模型组心肌细胞凋亡指数、Mfn2表达显著升高，p-Akt表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比较，丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA 40 mg组心肌细胞凋亡指数、Mfn2表达显著降低，p-Akt表达显著升高（P＜0.05），并显示出明显剂量依赖性。结论 丹参酮ⅡA可有效抑制心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡，抑制Mfn2表达是其可能的作用机制。

丹参酮ⅡA 缺血再灌注 心肌细胞 细胞凋亡 线粒体融合素2

心肌细胞凋亡是导致心肌缺血再灌注（I/R）后心功能不全及心律失常的主要因素［1］。线粒体融合素（Mfn2）及其产物具有负向调控磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的作用，从而在细胞凋亡过程中发挥重要作用［2］。丹参酮ⅡA可通过激活PI3K/Akt信号通路，介导细胞增殖、凋亡过程，从而发挥心肌保护、抗动脉粥样硬化等作用［3］。但丹参酮ⅡA对Mfn2的调控作用尚未明确。针对上述问题，研究选取心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象，观察辛伐他汀对心肌凋亡及Mfn2表达的影响，探讨丹参酮ⅡA抗心肌细胞凋亡的作用机制，为临床应用提供可靠依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（诺新康；上海第一生化药业有限公司产品，国药准字H31022558）；DMEM培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；Mfn2抗体、p-Akt抗体、Akt抗体（美国Santa Cruz公司）；免疫组化试剂盒（武汉博士德生物有限公司）；凋亡检测试剂盒（TUNEL法，德国Roche公司）。

1.2 实验动物 健康成年SD大鼠32只，雄性，SPF级，体质量220～270 g，购于同济医学院动物实验中心（动物合格证号:SCXK鄂2009-0003）。

1.3 分组与造模 将受试大鼠按随机数字表法分为4组，即假手术组、模型组、丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA 40 mg组，每组8只。丹参酮ⅡA 20 mg组、丹参酮ⅡA 40 mg组分别于术前7 d开始给予20 mg/（kg·d）、40 mg/（kg·d）的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液腹腔注射。假手术组、缺血再灌注模型组均给予等量蒸馏水腹腔注射。大鼠采用3%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，采用小动物呼吸机鼻面罩辅助通气，常规开胸，逐层分离胸膜、心包，于左心耳下缘、肺动脉圆锥水平纵轴上，以缝线穿圆形塑料套管结扎模型组、5 mg辛伐他汀组、10 mg辛伐他汀组大鼠左前降支并阻断血流。血流阻断成功标准:1）远端心肌出现苍白；2）心电图标准Ⅱ导联ST段出现弓背向上型抬高。阻断成功30 min后，剪开空心塑管，恢复血流，之后逐层关闭胸腔。假手术组开胸后于左前降支下穿线，但并不结扎。再灌注3 h后，常规取出心脏标本。

1.4 标本采集与检测 1）TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。上述心脏标本以4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋后切片。采用TUNEL法对切片进行染色，操作严格按试剂盒说明书进行，以细胞核染成棕黄色为阳性，每张切片于缺血再灌注损伤区域（假手术组于左室前壁区域）随机选取5个视野，记录阳性细胞数，并计算细胞凋亡指数（AI），AI（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。2）Western bolt法检测p-Akt表达。采用Western blot法检测心肌组织中p-Akt蛋白表达。常规提取组织蛋白，行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4 h，TBS缓冲液漂洗3次，加入相应一抗（抗p-Akt、抗Akt、抗α-actin）（1∶1000），4℃孵育过夜，TBS缓冲液漂洗3次，加入相应二抗（1∶500），室温孵育2 h，增强化学发光显色系统显色。3）免疫组化法检测 Mfn2表达。上述心脏标本以4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋后切片，采用免疫组化法检测Mfn2表达。严格按试剂盒操作说明进行，每张切片于缺血再灌注损伤区域（假手术组于左室前壁区域）随机选取5个视野，采用虚拟显微镜拍摄图片，使用图像分析软件测定Mfn2表达平均吸光度值。

1.5 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，多组间比较用单因素方差检验，两两间比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组心肌细胞凋亡情况比较 见表1、图1。TUNEL染色结果显示，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈棕黄色。假手术组未见心肌细胞凋亡；与假手术组相比较，模型组心肌细胞AI显著升高（P＜0.05）；与模型组相比较，丹参酮ⅡA组心肌细胞AI显著降低，且丹参酮ⅡA40mg组较丹参酮ⅡA 20 mg组变化更为显著（P＜0.05）

图1 各组心肌细胞凋亡情况比较（TUNEL染色，400倍）

表1 各组心肌细胞凋亡情况比较（%，±s）

表1 各组心肌细胞凋亡情况比较（%，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与丹参酮ⅡA 20 mg组比较，▲P＜0.05。下同。

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2.2 各组p-Akt蛋白表达水平比较 见表2，图2。Western bolt检测结果显示，与假手术组相比较，模型组心肌p-Akt蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比较，丹参酮ⅡA组心肌p-Akt蛋白表达显著增高，且丹参酮ⅡA 40 mg组较丹参酮ⅡA 20 mg组变化更为显著（P＜0.05）。

2.3 各组Mfn2蛋白表达水平比较 见表3，图3。免疫组化检测结果显示，与假手术组相比较，模型组心肌Mfn2蛋白表达显著增高（P＜0.05）；与模型组相比较，丹参酮ⅡA组心肌Mfn2蛋白表达显著降低，且丹参酮ⅡA 40 mg组较丹参酮ⅡA 20 mg组变化更为显著（P＜0.05）。

图2 各组心肌p-Akt蛋白表达水平比较

表2 各组心肌p-Akt蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组心肌p-Akt蛋白表达水平比较（±s）

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图3 各组心肌Mfn2蛋白表达水平比较（免疫组化，200倍）

表3 各组心肌Mfn2蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组心肌Mfn2蛋白表达水平比较（±s）

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3 讨 论

心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤过程中的标志性事件，其发生机制较为复杂，主要由缺血、缺氧及氧化应激等多种因素激活促凋亡基因、调控相关信号通路引起［4］。Ras-PI3K/Akt信号通路作为关键路径在促发心肌细胞凋亡中发挥重要作用，调节该信号通路相关基因表达，抑制心肌细胞凋亡，已成为预防心肌缺血再灌注损伤的新方向［5］。

丹参酮ⅡA作为传统中药丹参的有效成分之一，具有调节血脂、抗血栓及延缓动脉粥样硬化等作用，并被广泛应用于心血管疾病的治疗。近年来随着研究的深入，丹参酮ⅡA的细胞保护作用也日益受到关注［6］。研究证实，丹参酮ⅡA可通过抑制甲羟戊酸合成，阻碍小三磷酸鸟苷结合蛋白Ras异戊二烯化，调控Ras-PI3K/Akt信号通路及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，促进一氧化氮（NO）释放，减少活性氧（ROS）生成，具有显著的抗氧化、抗炎及抑制血管内皮细胞和心肌细胞凋亡的作用［7］。但丹参酮ⅡA对Mfn2信号通路上游信号分子的调控作用尚未完全明确。

Mfn2属于线粒体外膜蛋白，是近年来新发现的细胞信号通路调控点［8］。周炜等研究显示，血管平滑肌细胞中的Mfn2可通过线粒体途径对原癌基因Ras起到直接负调控作用，从而阻滞Ras-PI3K/Akt信号通路，抑制Akt磷酸化，进而抑制包括Bcl-2在内的促凋亡基因表达，促进包括Bax在内的抑凋亡基因表达，提示Mfn2在Ras-PI3K/Akt上游信号通路中起着关键的促凋亡作用［9］。但Mfn2在缺血再灌注损伤后心肌凋亡中的调控作用尚未明确。

本研究结果显示，急性心肌缺血再灌注损伤后，大鼠心肌组织切片缺血再灌注损伤区域可见Mfn2呈现高表达，而p-Akt呈现低表达，同时该区域内心肌细胞大量凋亡，提示心肌缺血再灌注损伤可能通过激活Mfn2表达，抑制Akt磷酸化，从而促进心肌细胞凋亡［10］。与模型组相比较，于术前采用丹参酮ⅡA进行干预，可显著抑制心肌细胞凋亡、下调Mfn2表达、上调p-Akt表达，且丹参酮ⅡA的调控作用呈现明显剂量依赖性，提示丹参酮IIA可能通过抑制促凋亡基因Mfn2表达，调控Ras-PI3K/Akt信号通路，进而达到抑制心肌细胞凋亡的作用［11-15］。

综上所述，Mfn2可能在心肌缺血再灌注损伤过程中起到促心肌细胞凋亡作用，而丹参酮ⅡA可通过抑制Mfn2表达，抑制心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞凋亡，从而实现其心肌保护作用。丹参酮ⅡA是否还通过其他信号分子或信号通路发挥心肌保护作用，仍有待进一步深入研究。

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The Effect of TanshinoneⅡA on Cardiomyocyte Apoptosis after Myocardial Ischemia/Reperfusion Injuryin Rats

HAN Ping，FENG Jun，CHEN Huawen.Zigui People′s Hospital，Hubei，Zigui 443600，China.

Objective:To evaluate the effect of TanshinoneⅡA on cardiomyocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury in rats.Methods:32 SD rats were randomly divided into sham-operation group，model group，20 mg TanshinoneⅡA group and 40mg TanshinoneⅡA group，8 rats in each group.The 20mg TanshinoneⅡA group and the 40mg TanshinoneⅡA group respectively were given 20 mg/（kg·d）and 40 mg/（kg·d）TanshinoneⅡA intraperitoneal injection 7d before the operation.The sham-operation group and the model group were given equivalent normal saline intraperitoneal injection.The myocardial ischemia/reperfusion injury model was induced by ligation of left anterior descending artery.In 3h after reperfusion，the hearts of each group rats were harvested.The cardiomyocyte apoptosis was detected by TUNEL method，the p-Akt expression was detected by western bolt，and the Mfn2 expression was detected by immunohistochemistry method.Results:Compared with the sham-operation group，the cardiomyocyte apoptosis index and Mfn2 expression of model group significantly increased，and the p-Akt expression significantly decreased（P＜0.05）.Compared with the model group，the cardiomyocyte apoptosis index and Mfn2 expression of the 20 mg TanshinoneⅡA group and the 40 mg TanshinoneⅡA group significantly decreased，and the p-Akt expression significantly increased（P＜0.05），and showed significantly dose-dependent manner（P＜0.05）.Conclusion:TanshinoneⅡA can inhibit the cardiomyocyte apoptosis after myocardial ischemia/reperfusion injury，and down-regulating the expression of Mfn2 may be its mechanism.

TanshinoneⅡA；Ischemia/reperfusion；Cardiomyocyte；Apoptosis；Mitofusin

·研究报告·

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1844-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.004

国家自然科学基金项目（81202825）

△（电子邮箱：andyterry555@163.com）

（2016-02-13）