甘露消毒丹对感染肠道病毒71型细胞miRNA-155表达的影响*

何宜荣贺又舜曹 蓉何 栋赵国荣艾碧琛△

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410000；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙410000）

·研究报告·

甘露消毒丹对感染肠道病毒71型细胞miRNA-155表达的影响*

何宜荣1贺又舜1曹 蓉1何 栋2赵国荣1艾碧琛1△

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410000；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙410000）

目的 观察甘露消毒丹及其残方对肠道病毒71型（EV71）感染后的RD细胞miRNA-155表达的影响。方法 运用细胞培养技术，设甘全方组、清残方组、利残方组、利巴韦林组、正常细胞对照组、模型对照组，将药物作用于EV71感染后的RD细胞，24 h后RT-PCR法检测各组细胞miR-155表达。结果 1）模型对照组、甘全方组、清残方组、利巴韦林组miR-155表达均比正常细胞对照组低，利残方组比正常细胞对照组升高（P＜0.05或P＜0.01）；甘全方组、清残方组、利残方组miR-155的表达比模型对照组高（P＜0.05或P＜0.01），利巴韦林组与模型对照组差异不明显（P＞0.05）；甘全方组、清残方组、利残方组miR-155表达比利巴韦林组升高（P＜0.05或P＜0.01），清残方组、利残方组的表达比甘全方组升高（P＜0.05或P＜0.01），利残方组最高。结论 EV71感染RD细胞后miR-155表达降低，与文献报道趋势不同，提示其表达可能具有细胞特异性；甘全方、清残方、利残方均能上调EV71感染后miR-155的表达从而调控免疫反应；利残方与清残方之间可能存在相互拮抗关系。

甘露消毒丹 残方 EV71 microRNA-155

手足口病是婴幼儿常见的传染性疾病，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患者并发呼吸道感染、心肌炎、无菌性脑膜炎、肺水肿等并发症后病情进展快，易发生死亡，近年手足口病疫情发生率及死亡率均有增高的趋势［1］。手足口病主要由小RNA病毒科的肠道病毒引起，其中以肠道病毒71型（EV71）及柯萨奇病毒A组16型（CoxAl6）型最常见。CoxA16引起的手足口病症状较轻，EV71可通过引起细胞免疫反应、炎症反应、导致神经系统血管变态反应等造成机体损害，尤其与手足口病的神经系统严重并发症密切相关，较其他病毒株更易导致出现重症、甚至死亡病例，故抗EV71是防治手足口病的研究重点。目前用于手足口病抗病毒的药品种类较少，缺乏特异高效的抗病毒药物，常选用阿昔洛韦、更昔洛韦、利巴韦林等，临床效果并不理想。中医学认为手足口病属 “时疫”“春温”“湿温”等范畴，甘露消毒丹清热解毒、利湿化浊，为治疗手足口病常用选方之一，临床疗效得到广泛肯定，但甘露消毒丹抗手足口病病毒的机制尚不明确。笔者前期研究发现甘露消毒丹有很强的抗EV71作用，并且其抗EV71效应体现在影响EV71复制的多个环节［2-3］，本研究在该基础上继续开展实验，以参与免疫炎症反应的重要miRNA中的miR-155［4-5］为观察指标，从基因水平观察甘露消毒丹对手足口病免疫反应的调节作用，同时对甘露消毒丹进行拆方研究，以期有助于阐明其配伍原理及作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒 人恶性胚胎横纹肌瘤细胞 （RD细胞），美国ATCC公司产品，DMEM培养液（含10%牛血清）培养，连续传代3次。细胞维持液为含1%双抗（青霉素、链霉素）、2%新生牛血清的DMEM；消化液为0.25%胰蛋白酶溶液。EV71病毒由武汉大学基础医学院医学病毒学研究所提供，EV71接种于单层RD细胞上，加维持液后置入35℃、5%CO2培养箱培养，待出现75%以上的病变时收获，冻融3次后吹打离心，4000 r/min，10 min，取上清，分装后-80℃冻存备用。

1.2 试剂与仪器 主要试剂:DMEM培养基，美国HyClone公司，批号SH30243.01B；胎牛血清，美国Hy-Clone公司，批号SV30087.02；胰蛋白酶消化液，美国Sigma公司产品，批号11476232；DMSO（二甲基亚砜），上海生工生物工程公司，批号2924B239；MTT（甲基偶氮唑蓝），上海生工生物工程公司，批号TB0799；DnaseI购自上海生工生物技术有限公司；SYBR Premix-ExTaqTM购自宝生物工程（大连）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas公司；RT-PCR试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；TRIzol购自Invitrogen公司；引物由宝生物工程（大连）有限公司代为设计、合成。主要仪器:生物安全柜，Haier公司产品；超微量紫外分光光度计，美国Thermo Fisher公司产品；高速冷冻离心机（Centrifuge5415R），德国eppendorf公司产品；荧光倒置显微镜，日本Olympus公司产品；荧光定量PCR仪（7900HT），美国ABI公司产品；凝胶成像分析系统，北京赛百奥科技有限公司产品。

1.3 药物及制备 甘露消毒丹（以下简称“甘全方”）:剂量参照《方剂学》［7］记载:飞滑石15 g，绵茵陈11 g，淡黄芩10 g，石菖蒲6 g，木通5 g，川贝母5 g，藿香4 g，白蔻仁4 g，连翘4 g，射干4 g，薄荷4 g。甘露消毒丹清热解毒残方（以下简称“清残方”）:淡黄芩10 g，薄荷4 g，连翘4 g，川贝母5 g，射干4 g。甘露消毒丹化浊利湿残方（以下简称“利残方”）:飞滑石15 g，绵茵陈11 g，木通5 g，白蔻仁4 g，石菖蒲6 g，藿香4 g。以上药材由湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供，请湖南中医药大学潘清平教授鉴定。按中药常规煎煮法煎煮2次，合并2次药液，制备成药液（含生药0.25 g/mL），用滤纸过滤后再以0.22 μm微孔滤膜过滤，4℃保存。利巴韦林注射液:规格100 mg/mL，江苏苏星制药有限公司产品（批号0110409），以蒸馏水配制成3 mg/mL溶液，4℃保存备用。

1.4 检测方法 1）病毒毒力测定。计算半数组织培养感染量 TCID50 （Reed-Muench法），实验采用100TCID50。具体测定步骤见课题组前期研究［2-3］。2）药物细胞毒性测定（MTT法）。计算其细胞存活率（以不同浓度药物的OD值计算），以细胞存活率（%）为纵坐标、药物浓度为横坐标（g/mL）绘非线性回归曲线。以90%细胞存活率浓度为各药的实验浓度。具体步骤见课题组前期研究［2-3］。3）药物干预实验。取RD细胞接种于无菌6孔细胞培养板，100 μL/孔，置入35℃、5% CO2培养箱24 h，待细胞长成单层后吸弃培养液，每孔接种病毒液50 μL，轻混，待吸附1.5 h后吸弃病毒液，将90%细胞存活率浓度的甘全方、清残方、利残方、利巴韦林药液50 μL与50 μL维持液混合，分别加到RD细胞上，各设4复孔，另每孔均设模型对照组、正常细胞对照组，正常细胞对照组孔内加维持液100 μL，病毒对照孔内接种病毒液50 μL，吸附1.5 h后吸弃病毒液，加入维持液100 μL。第24小时收集细胞，加入TRIzol，待RT-PCR法检测miRNA-155的相对表达。4）RT-PCR法检测细胞中miRNA-155的相对定量值（RQ）。采用TRIzol法分别提取甘全方组、清残方组、利残方组、利巴韦林组、模型对照组、正常细胞对照组细胞总RNA，将所提取的总RNA用超微量紫外分光光度计分别测定260 nm和280 nm处吸光度（A）值，计算各组OD260/OD280值，若样品纯度符合实验要求，则进行基因检测。采用反转录试剂盒与miRNA-155与U6反转录酶引物，以37℃30 min，65℃10 min，42℃60 min，70℃5 min进行孵育合成cRNA，-20℃保存。采用miR-155及U6的SYBR Premix Ex Taq进行扩增，总体系30 μL，分三重复孔，95℃30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，共计40个循环（荧光定量PCR）。采用2-△△Ct方法，以第1个样为1，计算待测基因的相对定量值（RQ）。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。各检测RQ值换算成（±s）表示，进行单因素方差分析，若方差齐性则进一步组间两两比较用t检验。若方差不齐，则用非参数检验的Tamhane′s T2法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病毒毒力测定 根据Reed-Muench法计算得出TCID50=10-2.89/mL，详细数值报告见前期研究［2-3］。

2.2 药物细胞毒性测定 根据各药物不同浓度的OD值，以细胞存活率（%）为纵坐标、药物质量浓度为横坐标（g/mL）绘出非线性回归曲线，通过回归曲线获得各实验用药90%细胞存活率质量浓度分别为:甘露消毒丹0.0037 g/mL，清残方0.0020 g/mL，利残方0.0081 g/mL，利巴韦林0.64 mg/mL。回归曲线图见前期研究［2-3］。

2.3 RNA电泳图 见图1。

图1 RNA电泳图

2.4 RNA鉴定 见表1。OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间，说明RNA纯度符合实验要求。

2.5 各组细胞中miRNA-155相对定量值 miR-155和U6的扩增曲线见图2～图3。按照2-△△Ct方法，以第一个样为1，计算miR-155的相对定量值（RQ），结果见表2。模型对照组、甘全方组、清残方组、利巴韦林组miRNA-155表达均比正常对照组低 （P＜0.05或P＜0.01），而利残方组比正常细胞对照组高（P＜0.01）；甘全方组、清残方组、利残方组miRNA-155的表达均比模型对照组高（P＜0.05或P＜0.01），病毒唑组与模型对照组差异不明显；清残方组、利残方组miRNA-155表达比甘全方组升高（P＜0.05或P＜0.01），利残方组的表达比清残方组高（P＜0.01）；病毒唑组的表达则比甘全方组、清残方组与利残方组低 （P＜0.05或P＜0.01）。

表1 RNA鉴定结果

图2 miR-155扩增曲线（n=3）

图3 U6扩增曲线

表2 各组miR-155 RQ值（±s）

表2 各组miR-155 RQ值（±s）

与正常细胞对照组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与甘全方组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01；与清残方组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01；与利残方组比较，＆P＜0.01。

组别 n miR-155模型对照组 3 1.00±0.15□□正常细胞对照组 3 1.55±0.05甘全方组 3 1.28±0.07□△利残方组 3 1.42±0.04□△△○清残方组 3 1.93±0.19□□△△○○※※利巴韦林组 3 1.06±0.05□□○※※＆

3 讨 论

EV71感染造成机体损害主要是其引起的细胞免疫反应导致神经系统血管变态反应和组织炎症病变。有研究对手足口病死亡患者进行尸检发现脑干和脊髓存在广泛炎性细胞浸润，合并肺水肿的手足口病患者辅助T淋巴细胞、白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）明显低于无肺水肿的患者，而轻型手足口病与重型手足口病比较，体液免疫中的中和抗体无明显差异［7］，这些都提示手足口病时机体出现明显的免疫反应，其中造成机体损害的主要是细胞免疫。

microRNA是内源性非编码RNA，其靶基因十分广泛，可以调节代谢、免疫、增殖、分化和癌变等多种生物学过程，其中miR-155是可以同时被细菌和病毒激活的miRNA，它可参与B淋巴细胞、T淋巴细胞等免疫细胞的分化、活化，是维持正常免疫功能必须的因子，能在病毒和细菌感染的初始免疫中发挥作用。研究发现炎症应激状态下由于TLR配体和前炎症因子的作用，巨噬细胞和树突细胞miR-155表达增高［8-10］，而miR-155基因敲除鼠T细胞依赖的抗体反应以及细胞因子产生减少［11］，同时树突细胞的抗原呈递功能受限［12］等，都说明miR-155参与调节体内炎症过程［13］。

中药治疗病毒感染性疾病除了直接抗病毒外也有间接调节作用，主要是调动机体免疫防御系统，如增强吞噬细胞的吞噬能力、调节细胞免疫和体液免疫、增强自然杀伤细胞活性等。笔者前期研究发现甘露消毒丹及其残方能直接抗EV71［2-3］，那么它们是否也能通过调节micro RNA来调节EV71感染后的机体免疫？为此我们进一步开展本实验，观察甘露消毒丹及其残方对miR-155表达的影响。但是研究结果却显示RD细胞在感染EV71后miR-155表达下降。有文献报道用脂多糖刺激小鼠THP-1细胞或巨噬细胞后，miR-155表达增加［14］，体外实验也发现单核/巨噬细胞在炎症因子作用下诱导miR-155高表达［4］等，与我们观察到的EV71感染机体后miR-155下降的趋势相反，这也许是因为不同病原微生物感染后的识别受体与信号转导通路不同，也可能与microRNA的表达具有组织和细胞特异性相关，正如有研究发现脂多糖刺激THP-1细胞后miR-146a/b表达升高［15］，而刺激B细胞和T细胞后miR-146a/b表达减少［16］，这或许也提示miRNA调节免疫反应的机制并非单一线性机制。

同时研究还发现甘露消毒丹及其残方均能以不同程度上调miR-155的表达，这提示甘露消毒丹及其残方可通过调节miR-155而调控免疫反应，而病毒唑则未能表现出相似的调控作用。我们前一部分实验发现甘露消毒丹能从EV71复制的多个环节发挥抗EV71的作用［2-3］，而本部分实验发现甘露消毒丹能通过调节miR-155来调节免疫，可见甘露消毒丹治疗EV71感染的作用是多重的，这也正好体现了中医复方多靶点、多环节的调节特点。

但RD细胞感染EV71后miR-155为什么是下降，miR-155下降后是通过哪条途径来影响EV71感染引起的免疫反应、效应如何，甘全方、清残方、利残方又是通过怎样的通路上调miR-155、如何发挥良性治疗作用，这些在本实验中都无法作出说明，还须更多的实验进行进一步的研究。

此外，甘全方、清残方、利残方3方之中，利残方调节miR-155作用最明显，甘全方的调节作用最弱，这与前一部分实验中发现的甘全方抗病毒作用反而弱于清残方［2］有相似之处，这提示我们无论在抗EV71方面还是在免疫调节方面，利残方与清残方之间都可能存在相互拮抗的关系，若对这种拮抗关系进行进一步研究，对揭示中医复方配伍的奥秘将会是一件非常有意义的事。

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Effects of Ganlu Xiaodu Decoction on the Expression of MiR-155 in EV71 Infected Cells

HE Yirong，HEYoushun，CAO Rong，et al. Institute of Traditional Chinese Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410000，China.

Objective:To observe Ganlu Xiaodu decoction and its incomplete prescriptions'effects on MiR-155's expression in RD cells infected by EV71.Methods:With technique of cell culturing，Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group，incomplete Li prescription therapy group，normal cells control group，model control group and ribavirin control group were set，and then the expressions of miR-155 in these groups after intervention with drugs in 24 hours were detected by RT-PCR.Results:1）Compared with normal cells control group，expression of miR-155 of model control group，Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group and ribavirin control group all decreased，but that of incomplete Li prescription therapy group increased.2）Levels of miR-155 in Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group were higher than model control group，but ribavirin control group had no significant difference with model control group.3）Levels of miR-155 in Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group were higher than ribavirin control group，and levels of miR-155 in incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group were higher than Ganlu Xiaodu decoction therapy group，and level of miR-155 in incomplete Li prescription therapy group was the highest.Conclusion:Expression of miR-155 in EV71-infected RD cells decreases；the result is not consistent with what other literature reported，which indicates that expression of miR-155 may have cell specificity.Ganlu Xiaodu decoction，its incomplete Qing prescription and incomplete Li prescription all can regulate the immune reactions caused by infection of EV71 by increasing miR-155′s expression.And there probably are antagonism effects between incomplete Qingprescription and incomplete Li prescription.

Ganlu Xiaodu decoction；Incomplete prescription；EV71；MicroRNA-155

·研究报告·

R512.5

A

1004-745X（2016）10-1840-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.003

国家自然科学基金项目（81173188）；湖南中医药大学“中医经典理论与经方应用研究”科技创新团队项目

△（电子邮箱：cz_abc0719@163.com）

（2016-02-15）