复方竹叶石膏颗粒对急性放射性食管损伤家兔免疫功能的调节作用*

王丽娟 路军章李明伟 牛宝龙 曲宝林

（解放军总医院，北京 100853）

复方竹叶石膏颗粒对急性放射性食管损伤家兔免疫功能的调节作用*

王丽娟 路军章△李明伟 牛宝龙 曲宝林

（解放军总医院，北京 100853）

目的 观察复方竹叶石膏颗粒对急性放射性食管损伤家兔免疫功能的调节作用。方法 40只清洁级雄性家兔随机分为空白对照组、单纯照射组（模型组）、复方竹叶石膏组、康复新液组，每组10只，除空白对照组以外，其余组家兔均以直线加速器6MV-X线一次照射32 Gy，建立家兔急性放射性食管损伤模型，各组均按不同治疗方法于照射前1周灌胃至照射完成后1周结束，每日1次。用流式细胞仪检测CD4+、CD8+百分比，用免疫浊度法检测IgG及补体C3的含量。结果 放射线导致急性放射性食管损伤家兔血中CD4+与CD8+的百分比、CD4+/CD8+值和IgG与补体C3的水平降低；与模型组比较，药物组提高家兔外周血CD4+、CD4+/ CD8+、IgG及补体C3的值（P＜0.05）；与康复新组比较，复方竹叶石膏颗粒组在提高IgG与补体C3水平效果更为显著（P＜0.05），外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较无统计学差异（P＞0.05）。结论 复方竹叶石膏颗粒对急性放射性食管损伤家兔的免疫功能具有显著修复作用。

急性放射性食管炎（RE） 复方竹叶石膏颗粒 免疫功能

肺癌、食管癌、纵隔肿瘤等颈胸部恶性肿瘤患者放射治疗后，与放疗前相比CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgG及补体C3数值下降［1-2］，造成患者机体免疫功能低下，常常诱发急性放射性食管损伤［3］，加之恶性肿瘤患者本身就常伴有机体免疫功能异常的表现［4］，同时免疫功能低下也可能是放射性食管炎迁延难愈的一个相关因素。复方竹叶石膏颗粒［5-6］由经方竹叶石膏汤加味而来，是治疗急性放射性食管损伤效果较为显著的中药制剂，但其在免疫功能方面的影响尚不明确。本实验通过建立急性放射性食管损伤家兔模型，以临床上治疗急性放射性食管炎效果较为显著的康复新液［7-8］作为阳性对照药，从家兔血清CD4+、CD8+、IgG及补体C3的变化探讨复方竹叶石膏颗粒对急性放射性食管炎的免疫调节作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 中国家兔40只，SPF级，雄性，体质量（2.0±0.1）kg，购自解放军总医院动物实验室［动物合格证号SCXK（京）2015-0005］。温度20～22℃；湿度50%～65%；通风控制在 3.2 m2/h；噪音控制在60 dB以下。

1.2 试药与仪器 1）实验药品:复方竹叶石膏颗粒［5，8］由经方竹叶石膏汤（竹叶15 g，生石膏30 g，太子参5 g，麦冬30 g，法半夏15 g，生甘草6 g）加入生薏苡仁30 g，莪术15 g，冬凌草15 g，白花蛇舌草30 g，半枝莲15 g共11味药组成，原颗粒制剂为12 g/袋（北京东升制药厂，批号20160111）。本实验药物按原方剂量配伍比例采用传统煎药法煎取药液，以恒温水浴锅浓缩成含生药2.0 g/mL的浸膏，分装灭菌，4℃保存备用。根据成人（70 kg）临床用量，按家兔等效剂量折算系数3.27换算给家兔。康复新液 （100 mL/瓶，国药准字Z51021834，四川好医生攀西药业有限责任公司）；3%戊巴比妥钠所有药品均购买于解放军总医院。2）实验试剂:Anti-Rabbit CD4 FITC（型号MRB4035，美国Antigenix公司）；Anti-Rabbit CD8 FITC（型号MRB803，美国Antigenix公司）；免疫球蛋白IgG和补体C3试剂盒购自上海太阳生物技术公司。3）实验仪器:直线加速器（Synergy，6MV能量，剂量率550 mu，瑞典医科达公司）；流式细胞仪（型号BDLSRII，美国B-D公司）；标仪（型号Denley Dragon Wellscan MK 3，芬兰Thermo公司，分析软件:Ascent software for Multiskan）；洗板机（型号Wellwash 4 MK2，芬兰Thermo公司）；数字显示隔水式电热恒温培养箱 （型号PYX-DHS，规格4002×500，上海跃进医疗器械厂）；离心机（型号TGL-168，编号11-07，上海安亭科学仪器厂）；漩涡混合器（型号XW-80A，上海青浦沪西仪器）。

1.3 动物分组及模型制备 将40只中国家兔随机分为4组，每组10只:即空白对照组，单纯照射组（模型组），复方竹叶石膏颗粒组，康复新组。除空白对照组外，其余3组均进行急性放射性食管损伤造模。3%戊巴比妥30 mg/kg耳缘静脉注射，将家兔麻醉，用加固型热塑性塑料固定膜将家兔固定于罩下，保证家兔身体中立位，仰卧在放射治疗模拟机下对食管定位，以6-MV直线加速器一次照射32 Gy，源皮距为100 cm，照射野下界位于膈肌食管裂孔下，以食管为中心，包括部分胃，长7 cm，宽3 cm。以6 mV-X直线加速器一次性照射32 Gy，时间为5 min 20 s。造模成功后，空白对照组及单纯照射组:0.9%氯化钠注射液5 mL/（kg·d）。复方竹叶石膏颗粒组予含生药9.16 g/（kg·d）的复方竹叶石膏颗粒浸膏。康复新液组予康复新液，含生药量3.3 mL/（kg·d）。以上各组均于照射前1周给药至照射结束后1周停药，每日1次。各给药组均用连接灌胃针的注射器通过开口器插入舌根部，缓慢注入药物，让家兔自行吞咽，每日1次，疗程为14 d，即于照射前1周给药至照射结束后1周停药。

1.4 观察指标及实验方法 各组均于照射完成后1周取血，肝素抗凝。各组均于照射完成后1周于家兔耳源静脉处麻醉后取血，肝素抗凝，用于T淋巴细胞亚群分析及血液分析，急速注射1.5～2 mL/kg（50 mg/mL）戊巴比妥钠处死，迅速取出家兔全长食管留以实验使用。1）流式细胞仪检测家兔外周血淋巴细胞CD4+、CD8+细胞百分率，同时计算CD4+/CD8+:每样本分别取100 μL至两个流式管底部，分别加入CD4 FITC、CD8 FITC荧光标记抗体10 μL，同时设置不加抗体的阴性对照管；混匀后室温避光孵育20 min，加入2 mL红细胞裂解液工作液，室温避光裂解红细胞10min；放入离心机，300 g离心5 min弃上清；加入2 mL流式细胞染色液重悬细胞，混匀后放入离心机，300 g离心5 min弃上清；加入500 μL流式细胞染色液重悬，及时上流式细胞仪检测分析。2）采用双抗体夹心ABC-ELISA法测量家兔血清中IgG及补体C3含量。分别用抗兔IgG和C3单抗包被于酶标板上，经过加样洗板等步骤用酶标仪在450 nm处测OD值，根据样品OD值计算出相应IgG和C3含量，再乘上稀释倍数即可。

1.5 统计学处理 应用SSPS18.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间差异采用完全随机单因素方差分析 （One-way ANOVA），均数的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组家兔外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+的变化 见表1。与空白对照组相比，其余3组外周血淋巴细胞CD4+、CD8+、CD4+/CD8+绝对值均下降（P＜0.05）；与单纯照射组相比，复方竹叶石膏颗粒组和康复新液组CD4+、CD4+/CD8+数值升高 （P＜0.05），CD8+变化无明显差异（P＞0.05）；复方竹叶石膏颗粒组和康复新液组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组照射完成后第7天各组家兔外周血中细胞免疫、外周血IgG与补体C3变化比较（±s）

表1 各组照射完成后第7天各组家兔外周血中细胞免疫、外周血IgG与补体C3变化比较（±s）

与空白对照比较，*P＜0.05；与单纯照射组比较，△P＜0.05；与康复新组比较，·P＜0.05

组 别 n CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+IgG（g/L） C3（g/L）空白对照组 10单纯照射组 10康复新液组 10 35.35±3.57 20.97±3.33 1.72±0.31 18.79±2.18*17.75±1.84*1.06±0.15*26.47±1.14*△15.67±1.85*1.70±0.15△1.93±0.18 0.47±0.14 1.17±0.24*0.23±0.04*1.58±0.08*△0.31±0.07*△复方竹叶石膏组 1026.96±1.75*△16.35±1.84*1.66±0.14△1.76±0.14*△·0.39±0.11*△·

2.2 各组家兔外周血IgG与补体C3的变化 见表2。与空白对照组相比，其余3组外周血IgG与补体C3绝对值均下降（P＜0.05）。与单纯照射组比较，复方竹叶石膏组和康复新液组IgG与补体C3数值较高 （P＜0.05）；复方竹叶石膏组与康复新液组比较，复方竹叶石膏组IgG及补体C3水平较高（P＜0.05）。

3 讨 论

急性放射性食管炎目前西医多采用消化道黏膜保护剂与“三素一麻”类药物进行对症治疗［9］，虽然可部分缓解患者的痛苦，但不能降低该病发生率，且免疫抑制及菌群失调等副作用明显［10］。中医药在防治急性放射性食管炎时表现出一定的优势，急性放射性食管炎中医学里多归属于“噎嗝”范畴，目前文献报道多为自拟汤剂如血府逐瘀汤［11］、芍根汤［12］、沙参麦冬汤［13］等。中成药方面报道较多的是康复新液，其成分主要为美洲大蠊虫。吴少兵等报道康复新液显著推后RE的发生时间，缩短持续时间，降低急性放射性食管炎级别［8］。周琼等报道其提高了小鼠外周血CD4+/CD8+比值，具有增强免疫的功效；还同时具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、促进组织修复等作用［14-15］。因此笔者选用康复新液作为本实验的阳性对照药。

笔者通过长期临床观察发现大多数急性放射性食管炎患者表现为口干咽干、吞咽疼痛、恶心呕吐，舌红少苔，脉细数，总结其病机为“热毒侵袭，气阴两伤，胃失和降”［6，16］。复方竹叶石膏颗粒在原方基础上加入白花蛇草、半枝莲、生薏苡仁等5味药，使其益气养阴的同时兼备清热解毒、燥湿和胃的功效，正切中急性放射性食管炎热毒侵袭的中医病机。笔者前期研究表明经方竹叶石膏汤加味防治本病能显著降低急性放射性食管炎发生率，推后急性放射性食管炎发生时间，缩短持续时间［6，16］，课题组进行竹叶石膏汤全方与拆方治疗急性放射性食管炎的动物实验研究，证实复方竹叶石膏颗粒能明显减轻急性放射性食管炎大鼠模型的病理损伤及炎性改变，改善饮食量及控制体质量下降，且呈现良好的量效相关性［17-18］，表明本方防治放射性食管炎疗效肯定，但其在免疫功能方面的影响尚不明确。因此本实验主要观察复方竹叶石膏颗粒在防治急性放射性食管炎时对其免疫功能的影响。

调节性T细胞亚群（Tregs）在恶性肿瘤患者接受放射治疗时的免疫反应中发挥重要调控作用［1］，其主要包括CD4+与CD8+等，CD4+细胞又称为辅助/诱导T淋巴细胞，CD8+又称为抑制/细胞毒T淋巴细胞。虽然淋巴细胞对放射性非常敏感，但越来越多的报道显示Tregs细胞是相对抗放射治疗的，放疗促进肿瘤局部微环境中Tregs繁殖［19］，从而使外周血T淋巴细胞数相对性降低。肿瘤局部增多的Tregs通过分泌IL_10、TGF-β等免疫抑制因子［20］和使抗凋亡蛋白下调（如Bcl-2蛋白）与促凋亡蛋白（Bax蛋白）上调等机制造成机体免疫功能异常等，其结果导致降低了恶性肿瘤患者放射治疗的有效率，并且诱发了急性放射性食管炎等并发症的产生［3］，因此，提高机体外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值变的尤为重要。本研究中动物实验结果显示，急性放射性食管炎家兔的免疫功能明显下降，与单纯照射组相比，复方竹叶石膏颗粒组和KFX组经预防性用药后家兔外周血中CD4+百分率及CD4+/CD8+比值升高，但CD8+变化无明显差异，其原因可能为单纯照射组家兔外周血中CD4+下降，而CD8+代偿性相对升高。复方竹叶石膏颗粒组和KFX组之间比较差异无统计学意义，表明复方竹叶石膏颗粒在改善细胞免疫功能方面同临床效果显著的康复新液［7-8，14］具有一致性。然而，复方竹叶石膏颗粒修复AR家兔细胞免疫功能方面的机制是否是通过抑制IL-10、TGF-β、Bcl-2等途径尚有待进一步研究。

血清免疫球蛋白（Ig）的测定是检查体液免疫功能最常用的方法，IgG是血清中主要抗体成分，约占75%，具有抗菌、抗病毒等作用，在机体免疫中起保护作用。C3是血清中含量最高的补体成分，在肿瘤的非特异性体液免疫中具有杀伤肿瘤细胞的作用。放射线造成食管黏膜上皮细胞脱落，炎性细胞浸润，导致机体IgG及C3水平降低，可能发生继发性细菌感染。本实验结果显示，单纯照射组急性放射性食管炎家兔外周血中IgG及补体C3水平明显下降，复方竹叶石膏颗粒组和KFX组IgG、C3水平升高，尤以复方竹叶石膏颗粒组升高较为显著，差异有统计学意义，表明复方竹叶石膏颗粒可以通过加强体液免疫对抗放射线导致的食管损伤，其原因可能为方药中所含药物具有抗菌抗病毒等功效，从而提高家兔外周血中IgG及补体C3水平。

综上所述，复方竹叶石膏颗粒是一种防治急性放射性食管损伤效果较为显著的药物，组方中包含多种具有抗炎、抗肿瘤、提高免疫力的单味中药。本实验结果表明，复方竹叶石膏颗粒对急性放射性食管炎家兔具有免疫调节作用，其机制是通过调节急性放射性食管炎家兔的细胞免疫及体液免疫功能，如提高外周血T淋巴细胞CD4+、CD4+/CD8+、IgG及C3的值。放疗患者应用该制剂不仅可以防治放疗引起的食管损伤的并发症，还可以提高患者机体免疫力，提高放疗对于癌症治疗的有效率。

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Im munostimulatory Effect of a Compound of Zhuye Shigao Oral Granule on Radiation-inducedEsophagitis

WANG Lijuan，LU Junzhang，LI Mingwei，et al. Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.

Objective:To study the immune repairing effect of a compound Zhuye Shigao Granule（CZYG）in treating rabbit radiation-induced esophageal injury.Methods:Forty rabbits，clean grade，male，were randomly divided into the blank control group，simple irradiation group（model group），CZYG group，and Kangfu Xinye group，irradiated with a linear accelerator of 6MV X ray at a dose of 32 Gy，except the blank control group，to establish the model of acute radiation-induced esophagitis（RE）.Each group was treated with different drugs and started from one week before the irradiation to one week after the completion of the irradiation，once a day.The percentage of CD4+and CD8+were detected by flow cytometry，and the content of IgG and complement C3 were detected by immune turbidity method.Results:The percentage of CD4+，CD8+，the value of CD4+/CD8+and the level of IgG and complement C3 decreased in the model group.The percentage of CD4+，CD8+，the value of CD4+/CD8+in the Peripheral Blood and the level of IgG and complement C3 were improved in the drug groups compared with model group（P＜0.05），and the level of IgG and complement C3 were more remarkable in the CZYG than Kangfu Xinye group（P＜0.05）.The comparison on the value of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in the Peripheral Blood had no statistical difference（P＞0.05）.Conclusion:This study suggests that CZYG is able to repair the impaired cellular and humoral immunity of rabbits with RE.

Radiation-induced esophagitis（RE）；Compound Zhuye Shigao Granule（CZYG）；Immune function

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1855-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.007

国家自然科学基金项目（81357553）

△（电子邮箱：lujunzhang@sina.com）

（2016-03-11）