若羌灰枣多糖提取工艺优化研究

魏金凤，贾玉华，闫 静，曹鹏然,2，雷璐倩，胡志宇，康文艺,2

1. 河南大学 中药研究所，河南 开封 475004； 2. 开封市保健食品功效成分研究重点实验室，河南 开封 475004； 3. 河南大学 民生学院，河南 开封 475004



若羌灰枣多糖提取工艺优化研究

1. 河南大学 中药研究所，河南 开封 475004； 2. 开封市保健食品功效成分研究重点实验室，河南 开封 475004； 3. 河南大学 民生学院，河南 开封 475004

〔目的〕 利用响应面分析法对新疆若羌灰枣多糖的提取进行优化，考察提取温度、时间、液料比对多糖提取率的影响。〔方法〕 在单因素试验的基础上选取试验因素与水平，根据Box-Behnken试验设计原理，确定其最佳提取工艺条件为：提取时间1.68 h，提取温度78.27 ℃，液料比27.36∶1。〔结果〕 在此最佳工艺条件下，枣多糖的提取率可达71.19%。〔结论〕 在此基础上采用Sevage法除去枣多糖溶液中蛋白质，在样品、Sevage为1∶1，氯仿、正丁醇为4∶1的条件下，研究萃取次数对蛋白质和多糖的影响，得出最佳萃取次数为6次。

多糖提取；响应面分析；脱蛋白

大枣(ZiziphusJujubaMill.)为鼠李科枣属植物，原产于中国，迄今为止已有4000多年的历史，在中国已经发现了700多个品种[1]。枣中含有三萜类、皂苷类、生物碱类、维生素类、酰胺类、核苷类、糖类、黄酮类、糖苷类、蛋白质、氨基酸类、有机酸类、 甾体类等化学成分[2]。其中，多糖含量最多，鲜果中的含糖量在40%以上，干果中的含糖量在 81.3%～88.7%[3]。大枣多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老等[4]。在食品工业中的应用也十分广泛，如改善食品的质地、形状、外观、口感、稠度等，可作功能性食品的开发，用作增稠剂、乳化剂、稳定剂等，具有广阔的市场和应用前景。多糖的提取尤为关键，是其广泛应用的基础。为进一步分离纯化、鉴定结构、揭示其药理作用及食用价值，我们以若羌灰枣为研究对象，考察提取温度、时间、液料比对多糖提取率的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新疆若羌灰枣，2016年1月购于开封市三毛超市；葡萄糖，成都普菲德生物技术有限公司；无水乙醇、浓硫酸(分析纯) ，开封东大化工有限公司试剂厂；苯酚(分析纯) ，天津基准化学试剂有限公司；石油醚(分析纯)，天津市富宇精细化工有限公司；考马斯亮蓝G-250染料(SERVA) ，Electrophoresis GmbH公司；85%的磷酸(分析纯) ，天津市福晨化学试剂厂；牛血清白蛋白(BSA)，成都普菲德生物技术有限公司。

5%的苯酚溶液的配置：称取苯酚5 g，加蒸馏水95 mL溶解，存放于棕色试剂瓶备用。

考马斯亮蓝G-250的配置：称取50 mg考马斯亮蓝G-250，用90%的乙醇25 mL溶解，加入85%的磷酸50 mL，最后用蒸馏水定容到500 mL。

牛血清白蛋白标准溶液的配置：称取10 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为0.1 mg/mL的标准液。

1.2仪器与设备

电热鼓风干燥箱(上海—恒科学仪器有限公司)；多功能粉碎机(铂欧五金厂)；电子天平(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)；电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；循环水式真空泵(北京中兴伟业仪器有限公司)；旋转蒸发器RE-2000B(郑州国瑞仪器有限公司)；旋转蒸发仪(EYELA,东京理化器械株式会社)；TGL-22台式高速冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司)；全波长酶标仪(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)。

1.3多糖的提取

1.3.1原料前处理清水洗净、去除枣核，烘干后粉碎后过60目筛。石油醚回流脱脂2 h，减压抽滤，挥干石油醚，枣粉备用。

1.3.2葡萄糖标准曲线的绘制称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖41 mg，置于50 mL容量瓶中，定容，摇匀。分别吸取葡萄糖标准溶液0，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，用蒸馏水定容至2.0 mL，加入5%的苯酚溶液1 mL摇匀。吸取5 mL浓硫酸加入试管中，静止10 min，摇匀，40 ℃水浴20 min，于490 nm处测定吸光度。绘制标准曲线，计算回归方程，如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线

1.3.3试验方法称取2.000 g大枣粉末，热水浸提后减压抽滤，取滤液浓缩至10 mL置于具塞试管中。加入4倍无水乙醇，摇匀，3 000 r/min离心10 min，取沉淀用蒸馏水复溶，定容于100 mL容量瓶中。按1.3.2测定吸光度，每次重复3次，结果以平均值计算。

1.3.4单因素试验设计以新疆若羌灰枣多糖提取得率为指标，分别考察提取温度、液料比、提取时间对多糖提取率的影响[4-5]。

1.3.5响应面法优化提取工艺

在单因素试验的基础上，选择提取温度、时间、液固比为自变量，运用Design Expert软件按照Box-Behnken设计3因素3水平的响应曲面法分析，并对数据进行多项式回归分析，建立二次响应回归模型，拟合二次回归方程，得到传统热水浸提法提取多糖的最佳工艺参数[6]。实验设计方案见表1。

表1　响应面分析因素与水平

1.4多糖的Sevage除蛋白

1.4.1样品溶液的配置精确称取提取的粗多糖0.503 6 g，用蒸馏水定容置于100 mL容量瓶中，形成终浓度为5 mg/mL多糖溶液。

1.4.2蛋白质标准曲线的绘制取6支10 mL具塞试管，分别加0.1 mg/mL标准蛋白液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，蒸馏水定容至1.0 mL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5 mL。盖塞混合均匀，放置2 min后在595 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，如图2所示。

图2　牛血清白蛋白标准曲线

1.4.3样品提取液中蛋白质浓度的测定取3支10 mL具塞试管，分别加入1.0 mL待测样品和5 mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀。放置2 min后，在595 nm波长下测定吸光度，计算待测样品提取液中蛋白质的含量。

1.4.4Sevage法脱蛋白取10 mL Sevage试剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)和10 mL粗多糖样液，混合后剧烈振摇15～20 min，4 000 r/min离心10 min，静置5 min。取上层水相溶液，定容到10 mL，测定其中糖、蛋白质含量。取8份样品，分别处理1，2，3，4，5，6，7，8次，每份样品重复3次。

1.5计算

式中：c为样品浓度，mg/mL；V为溶解样品体积，mL；D为稀释倍数；F为测吸光度时吸取体积倍数； m为称取样品质量，g；1 000为单位换算。

式中：m0为原样液中蛋白质量；m1为脱蛋白后样液中蛋白质量。

式中：M1为脱蛋白后样液中多糖质量；M0为原样液中多糖质量。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果分析

2.1.1温度对多糖提取率的影响固定浸提时间为1.5 h，液料比25∶1，考察温度对食用灰枣多糖提取率的影响。结果如图3所示。

图3　温度对多糖提取率的影响

由图3可知,随着温度的升高，多糖的提取率先增加后降低；当温度为80℃时，多糖提取率最高；之后，可能由于温度过高引起多糖结构破坏而发生降解。故推测最佳提取温度为80 ℃。

2.1.2液料比对提取率的影响固定浸提温度为80 ℃，时间为1.5 h，考察液固比对食用枣多糖提取率的影响。结果如图4所示。

图4　液固比对多糖提取率的影响

由图4可知,提取率随着液固比的增大而逐渐增大；但当液固比增大到25∶1后，提取率逐渐趋于稳定，液固比不再对提取率有大的影响。故液固比为25∶1时提取效果最好。

2.1.3提取时间对提取率的影响固定浸提温度80 ℃，液固比为25∶1，考察提取时间对新疆若羌灰枣多糖提取率的影响。结果如图5所示。

图5　时间对多糖提取率的影响

由图5可知,在0.5～1.5 h内随着时间的增加，提取率逐渐增加；在1.5 h后提取率下降，原因可能是加热时间长造成多糖结构破坏降解，且其他杂质不断溶出，使多糖提取率下降。

2.2响应面法优化试验结果

响应面试验设计方案与结果,如表2所示。

表2　响应面试验设计方案与结果

2.2.1方差分析与显著性检验利用软件对试验结果进行二次多项式回归拟合。对表2中的数据进行方差分析，得到模型的二次多项式回归方程：

提取率=70.11-2.30 A+2.00 B+2.23 C-

0.34 A B-0.98 A C+0.95 B C-

8.30 A2-3.52 B2-2.91 C2。

对该模型的方差分析结果见表3。

表3　方差分析与显著性检验

由表3可以看出，回归模型的F=71.12，P<0.000 1，表明试验所采用的二次模型极显著。模型可靠，对响应值拟合良好。

另外，一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2，即温度、时间、液固比对试验结果的影响极显著，而各因素交互项A B、A C、B C，即温度、时间和液固比之间交互作用对试验结果的影响不显著。

2.2.2响应面分析与优化根据回归方程绘制响应曲面图和等高线图，分析温度、时间和液固比及其交互作用对新疆若羌灰枣多糖提取率的影响。

图6为液固比为25∶1时，温度与时间的交互作用对提取率影响的响应曲面。由图可知：温度为70～90 ℃时提取率先增大后减小，温度为80 ℃时达到最大；时间为1～2 h时提取率先增大后减小，时间为1.6 h时达到最大。

图6　提取温度与提取时间的交互作用

图7为时间在1.5 h时，温度与液固比的交互作用对提取率影响的响应曲面。由图可知：温度为70～90 ℃时提取率先增大后减小，温度为80 ℃时达到最大；液固比在20∶1～30∶1时提取率先增大后减小，液固比为26∶1时达到最大。

图7　提取温度与液固比的交互作用

图8为温度为80 ℃时，时间与液固比的交互作用对提取率影响的响应曲面。由图可知：时间为1～2 h时提取率先增大后减小，时间为1.6 h时达到最大；液固比在20∶1～30∶1时提取率先增大后减小，液固比为26∶1时达到最大。

图8　提取时间与液固比的交互作用

2.3Sevage脱蛋白结果

通过牛血清白蛋白标准曲线(图2)计算得到新疆若羌灰枣粗多糖中蛋白质含量为28.320.4 mg/g。图9为Sevage脱蛋白结果。

图9　Sevage脱蛋白结果

由图9可知,随着萃取次数的增加，蛋白质脱除率会增加，多糖保留率会降低。这是因为Sevage除去蛋白质的同时，不可避免地会溶解部分多糖。另外与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白也会沉淀下来；同时萃取次数越多在分离糖液与蛋白质层时造成多糖的损失也越多。当萃取6次后，蛋白质脱除率趋于平稳，而多糖保留率还在逐渐减少，所以萃取6次为最佳次数。

3　结论

通过Design-Expert.8.05b软件对优化后的回归方程分析可得，多糖的最佳提取工艺条件为：温度78.27 ℃，时间1.68 h，液固比27.36∶1。在此最佳工艺条件下，新疆若羌灰枣多糖的最大提取率为71.19%。另外，Sevage法除多糖溶液中蛋白质的最佳萃取次数为6次。

4　讨论与展望

目前，多糖的提取方法有热水浸提法、酶提取法、超声辅助法和微波辅助法；脱蛋白的方法有sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法。热水浸提操作简单、实用、成本低，适用于大量提取多糖。影响提取效率的因素有提取温度、提取时间、液固比等。一般温度升高提取率高，但当温度升到一定程度时，多糖结构会破坏而导致提取率降低。同样，提取时间延长提取率增加，但当多糖完全溶出后继续提取会导致其他物质的溶出而降低提取率。另一个重要因素是液固比即水的用量：用量小，多糖会存留在大枣中；用量大，会给后期浓缩带来负担。因此，控制好提取温度、时间、和液固比对提取率的提高有很大影响。酶提取法、超声辅助法和微波辅助法虽快速、安全、简便，但成本高不适用于提取大量多糖。Sevage脱蛋白操作简单、温度低，能有效防止多糖降解，需要重复多次。重复次数少，蛋白质去除不干净，重复次数太多，会导致多糖损失严重和浪费试剂。因此，确定萃取次数对Sevage脱蛋白十分重要。在今后多糖的提取研究中，注重操作过程快速、安全、简便的同时降低成本，使现有的提取工艺进一步完善，与实际生产接轨，利于多糖的工业化生产。

[1] Gao Qinghan, Wu Chunsen, Wang Min. The jujube (ZiziphusJujuba Mill.) fruit: a review of current knowledge of fruit composition and health benefits[J]. Journal of agricultural and food chemistry. 2013,61:3351-3363.

[2] 刘世军，唐志书，崔春利，等. 大枣化学成分的研究进展[J]. 云南中医学院学报，2015,38(3):96-98.

[3] 陈熹，李玉洁，杨庆，等. 大枣现代研究开发进展与展望[J]. 世界科学技术—中医药现代化，2015,17(3):687-690.

[4] 陈晓青，蒋新宇，刘佳佳. 中草药成分分离分析技术与方法[M]. 北京：化学工业出版社，2006:210.

[5]冯艳波. 阿拉尔骏枣多糖的提取及其生物活性研究[D]. 新疆：塔里木大学，2014.

[6] 张俐勤，陶昆，范建奇，等. 响应面法优化荸荠皮保鲜物质微波提取工艺[J]. 保鲜与加工，2016,16(1):44-48.

[责任编辑李麦产]

Optimization of Extraction Process of polysaccharides from Ruoqiang grey jujube

1. Institute of Chinese Materia Medica, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Kaifeng Key Laboratory of functional components in health food, Henan Kaifeng 475004, China; 3. Minsheng College, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕This paper aimed at optimization of the extraction of Ruoqiang grey jujube polysaccharides by Response Surface Methodlogy, the study investigated extracting temperature, time and liquid ratio on the polysaccharide extraction yield.〔Methods〕On the basis of the previous results and according to the principle of Box-Behnken experiment design, the results showed that the best extraction technology conditions were determined as follows: extraction time 1.68 h, extraction temperature 78.27 ℃, liquid ratio of 27.36∶1.〔Results〕Under optimum conditions, the extraction rate of polysaccharides up to 71.19%.〔Conclusion〕On this basis of extract, jujube polysaccharides solution using sevage method eliminating the protein, under the conditions of the ratio of sample & Sevage is 1∶1, and the ratio of chloroform & n-butanol is 4∶1, studied the extraction times effect of protein and polysaccharides, finding the best extracted six times.

polysaccharides etract; response surface methodlogy; eproteinized

1672-7606(2016)03-0167-05

2016-07-20

2016年度河南省高校科技创新团队药食两用资源研究开发项目(16IRTSTHN019)；河南省科技厅基础前沿计划(142300410123，152300410064)；开封市创新人才项目(1509010)；河南大学民生学院教育教学改革研究项目(MSJG2015007，MSJG2015040)；河南大学2016年度大学生创新创业训练计划项目(16NA058)

魏金凤(1975-)，女，河南开封人，副教授，博士。从事药用植物活性成分研究。

康文艺(1971-)，男，黑龙江尚志人，教授，博士后，河南大学药学院副院长。从事天然产物化学、中药活性成分研究。

R28

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