姜黄素减弱Aβ25-35致大鼠原代小胶质细胞的神经炎症反应*

刘绪华， 王孝庆， 王中苏， 赵 航， 钱小伟， 曹 红， 李 军

(温州医科大学附属第二医院麻醉科，浙江 温州 325027)



姜黄素减弱Aβ25-35致大鼠原代小胶质细胞的神经炎症反应*

刘绪华， 王孝庆， 王中苏， 赵 航， 钱小伟， 曹 红， 李 军△

(温州医科大学附属第二医院麻醉科，浙江 温州 325027)

目的： 研究姜黄素(Cur)对β-淀粉样蛋白(Aβ)刺激下大鼠原代小胶质细胞活力及高迁移率族蛋白1(HMGB1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响。方法：取新生SD大鼠大脑皮层行混合胶质细胞原代培养，摇床振摇法分离小胶质细胞并行Iba-1免疫细胞化学鉴定。在培养的小胶质细胞中加入Aβ25-35作用24 h后，观察细胞形态并用CCK-8实验确定造模浓度及Cur的治疗浓度。将大鼠原代小胶质细胞分为5组：正常组、Aβ25-35模型组、Cur组、Aβ25-35+Cur治疗组、Aβ25-35+DMSO组；用Western blot法检测细胞内HMGB1、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、NF-κB的表达情况，取上清液用ELISA检测HMGB1、IL-1β、TNF-α的表达。结果：Iba-1的阳性率在95%以上，培养的大鼠原代小胶质细胞可用于实验。Western blot实验结果示Aβ25-35活化诱导后，细胞内的HMGB1、RAGE和NF-κB表达明显升高(P<0.05)，加入姜黄素后细胞内的HMGB1、RAGE和NF-κB表达明显减少(P<0.05)。ELISA结果示Aβ25-35活化诱导后，细胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α明显升高(P<0.05)，加入姜黄素后上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α明显下降(P<0.05)。结论：姜黄素可明显抑制Aβ25-35刺激下大鼠原代小胶质细胞的神经炎症反应。

阿尔茨海默病； 姜黄素； β-淀粉样蛋白； 小胶质细胞； 高迁移率族蛋白1

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种常见进行性神经退行性疾病。目前认为β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)沉积引发的神经炎症反应在AD过程中起核心作用，这一炎症过程由激活小胶质细胞(microglial，MG)诱导产生的炎性因子以及相关信号通路所驱动，最终导致突触和神经元的损害[1]。高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，可直接促进炎症介质释放，调节炎症反应和组织损伤，因此HMGB1被认为是一些神经退行性疾病的危险因素[2-4]。姜黄素(curcumin，Cur)是从传统中药姜黄的根茎中提取出来的一种脂溶性酚类色素，具有抗炎、抗氧化、抗斑块、清除氧自由基、抗纤维化及防癌、抗癌等多种药理作用[5]。本研究采用大鼠原代培养小胶质细胞，用Aβ的活性片段Aβ25-35诱导活化大鼠原代培养小胶质细胞建立炎症模型，观察姜黄素对Aβ刺激下大鼠原代小胶质细胞活力、HMGB1、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达的影响，探讨姜黄素对AD作用的可能机制。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级SD大鼠，雌雄不限，1～3 d 龄，由温州医科大学实验动物中心提供,动物许可证编号为SCXK(浙)2010-0044。小胶质细胞由大鼠大脑皮层分离提取。

2 主要试剂

Aβ25-35、姜黄素购自Sigma；DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco；anti-Iba1 antibody购自Wako；CCK-8检测试剂购自Dojindo；晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)抗体、HMGB1抗体、NF-κB抗体、Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)抗体购自Abcam；小鼠HMGB1、IL-1β和TNF-α ELISA检测试剂盒购自R&D；小鼠多克隆抗β-actin抗体购自Bioworld。

3 主要方法

3.1 大鼠原代小胶质细胞的培养和纯度鉴定 取新生1～3 d 的SD大鼠，消毒后沿头部纵轴打开颅腔分离出大脑皮质，置于胰蛋白酶中剪成细小碎块并消化5 min，加入等体积DMEM/F12培养基终止消化，吸管吹打分散成单细胞悬液并过滤。滤过液离心后吸去上清液，用上述DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，以4×108/L细胞数接种于多聚赖氨酸包被的25 mL培养瓶中，置37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养箱中培养，约9～10 d细胞长满瓶底后再次换液，次日置于37 ℃恒温摇床中以260 r/min振速摇动处理2 h，收集摇晃下来的细胞悬液并接种到25 mL培养瓶和放置于盖玻片的6孔板中，37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养箱中培养1 h，弃去未贴壁细胞，获得的细胞即为纯化的小胶质细胞。将原代小胶质细胞接种于6孔板中，用Iba1多克隆抗体(1∶500)标记小胶质细胞，用DAPI染核在荧光显微镜下观察、采集图像。通过计数阳性细胞计算细胞纯度，随机抽取10张细胞盖片显微镜下观察和照相并随机抽取10个视野计数阳性细胞，用Iba1染成红色的为小胶质细胞(阳性细胞)。计算其与视野内总细胞(用DAPI染成蓝色)的比值，其平均值即为细胞纯度，阳性率大于95%以上即可用于实验。

3.2 CCK-8法测细胞活力 取大鼠原代小胶质细胞，经胰酶消化后，吹打成单细胞悬液，将各组细胞按5×107/L的密度接种于96孔板上。16～24 h后细胞单层铺满孔底，小心吸去孔内培养液，换液，各组加入不同梯度的药物浓度。孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。细胞活力(%)=(各处理组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)。

3.3 实验分组 将大鼠原代培养小胶质细胞分为5组：正常组(normal cell组)：不做任何处理； Aβ25-35模型组：40 μmol/L Aβ25-35刺激细胞24 h；Cur组：加入终浓度为10 μmol/ L 的Cur孵育(姜黄素被溶解于DMSO中)细胞24 h； Aβ25-35+Cur治疗组：同时加入10 μmol/L的姜黄素和40 μmol/L的Aβ25-35共同孵育细胞24 h； Aβ25-35+DMSO组：同时加入终浓度为10 μmol/L的Aβ25-35和0.2% DMSO共同孵育细胞24 h。

3.4 Western blot分析 细胞接种在6孔板中，分组方法同上。24 h后收获细胞，提取细胞总蛋白，经制胶、上样、电泳、转膜、封闭、孵育 I 抗、 II 抗后曝光，用Quantity One软件分析目的蛋白HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB、内参照蛋白β-actin的平均光密度值。

3.5 ELISA检测HMGB1、IL-1β、TNF-α在培养上清中的浓度 细胞接种在6孔板中，分组方法同上。24 h后提取上清液。按ELISA试剂盒说明书操作，测定上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α的浓度。用酶标仪测定标准品及样本吸光度值，根据标准品的浓度和吸光度绘制标准曲线，计算样本HMGB1、IL-1β、TNF-α浓度。

4 统计学处理

实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 19.0及GraphPad Prism5统计学软件进行统计分析并作图。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐则组内两两比较采用SNK-q检验，否则采用Tamhane’s T2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠原代小胶质细胞培养结果

1.1 倒置显微镜下观察细胞形态 混合细胞培养24 h后，细胞贴壁，可见透光性较好的小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元细胞及部分红细胞。10 d左右细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。通过机械振摇法分离后的小胶质细胞形态基本不变。接种约1 h后，小胶质细胞贴壁。培养24 h后，小胶质细胞完全贴壁，形态不规则，多为蜘蛛状、梭形及椭圆形，见图1。

Figure 1.The morphological observation of the microglial cells after purification by mechanical shaking separation under inverted microscope.

图1 倒置显微镜正常小胶质细胞形态

1.2 小胶质细胞的纯度鉴定 Iba-1是小胶质细胞、巨噬细胞表面的特异性抗原，且不会与神经元、星形胶质细胞发生交叉反应。小胶质细胞Iba-1免疫荧光术鉴定显示小胶质细胞阳性率达95%以上，见图2。

Figure 2.The specific marker Iba-1 expression of microglia by immunofluorescence staining.

图2 小胶质细胞中特异性标志物Iba-1的表达

2 造模浓度、时间和治疗浓度的确定

2.1 Aβ25-35对大鼠原代小胶质细胞存活率的影响 在细胞培养基中加入不同浓度的Aβ25-35(5、10、20、40、80 μmol/L)，细胞活力明显下降，且呈时间与剂量依赖性(P<0.05)，见表1。如图3所示，小胶质细胞诱导后6 h细胞活力开始下降，约24 h 下降达高峰值，此后为一平台，细胞活力变化不大。故选择造模时间为24 h，通过计算得到其半抑制浓度(IC50)为63.17 μmol/ L，为此选择Aβ25-35的造模浓度为40 μmol/ L。

2.2 姜黄素对大鼠原代小胶质细胞存活率的影响 观察不同浓度姜黄素(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)

Figure 3.The effect of Aβ25-35at different concentrations on the activity of microglia at different time points. Mean±SD.n=16.

图3 Aβ25-35对小胶质细胞活力的影响

表1 不同浓度Aβ25-35作用不同时间对小胶质细胞活力的影响

Table 1.The effects of Aβ25-35on the viability of microglial cells at different concentrations and different time points (Mean±SD.n=16)

Aβ25-356h12h24h36h48h0μmol/L100.12±15.02125.32±9.36130.45±12.35128.34±16.18135.24±12.615μmol/L97.34±13.15*98.73±5.14**90.48±8.13**91.24±19.25**92.75±20.27**10μmol/L95.75±15.04*90.89±6.08**85.73±19.31**87.35±4.05**85.36±17.31**20μmol/L90.58±21.24*85.36±15.03**80.16±8.27**78.54±22.16**79.38±3.62**40μmol/L87.34±13.17*80.58±2.02**75.56±21.26**74.39±6.34**72.56±21.38**80μmol/L75.78±5.26**50.58±21.01**45.49±16.16**47.57±14.26**40.67±17.39**

*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L group.

作用24 h后对小胶质细胞存活率的影响。如图4所示，20 μmol/L Cur对细胞的毒性明显强于阴性对照组和其它几组，抑制率可达51.7%。因此选择对小胶质细胞没有抑制作用的最高姜黄素浓度为10 μmol/ L，与空白对照组相比差异无统计学显著性。

3 倒置显微镜下各组小胶质细胞形态学改变

正常组小胶质细胞在孵育4 h左右即能贴壁，胞体较小，少量细胞有细小突起；Aβ25-35组和Aβ25-35+DMSO组贴壁速度明显慢于正常组，细胞出现聚集状态，胞体伸出一个或多个树枝状突起，连接周围细胞，突起粗大；Cur组和Aβ25-35+Cur组的细胞胞体肥大，核仁明显，细胞间以突触相连，见图5。

4 Aβ和姜黄素对大鼠小胶质细胞HMGB1表达的影响

与正常组相比，Aβ25-35活化诱导24 h后，HMGB1的表达明显升高(P<0.05)，单纯姜黄素处理对HMGB1影响不明显。Aβ25-35+Cur组加入姜黄素共同孵育后，与Aβ25-35组相比，HMGB1明显下降(P<0.05)，而DMSO与Aβ25-35(DMSO为姜黄素的溶剂)共同孵育后，HMGB1表达较Aβ25-35组差异无统计学显著性，见图6。

Figure 4.The effect of Cur at different concentrations on the activity of microglia cells. Mean±SD.n=15.*P<0.05vs0 μmol/L.

图4 Cur对小胶质细胞活力的影响

Figure 5.The morphological changes of the microglia under inverted microscope (×20).

图5 倒置显微镜下小胶质细胞的形态改变

5 Aβ和姜黄素对大鼠小胶质细胞RAGE、TLR4及NF-κB表达的影响

Aβ25-35活化诱导24 h后，RAGE、TLR4 and NF-κB的表达明显升高(P<0.01)，单纯姜黄素处理对三者无明显影响,Aβ25-35和姜黄素共同孵育后，RAGE、TLR4和NF-κB均明显下降(P<0.05)。DMSO与Aβ25-35共同孵育后，RAGE、TLR4、NF-κB表达较Aβ25-35组差异无统计学显著性，见图6。

6 Aβ和姜黄素对大鼠小胶质细胞培养上清中HMGB1、IL-1β和TNF-α浓度的影响

与正常组相比，Aβ25-35活化诱导24 h后，上清液中的HMGB1、 IL-1β和TNF-α明显升高(P<0.01)。Aβ25-35与姜黄素共同孵育后，HMGB1、 IL-1β和TNF-α明显下降(P<0.01)。DMSO与Aβ25-35(DMSO为姜黄素的溶剂)共同孵育后，HMGB1、IL-1β和TNF-α较Aβ25-35单独处理组的差异无统计学显著性，见图7。

Figure 6.The protein levels of HMGB1, RAGE, TLR4 and NF-κB in the microglia with different treatments. Mean±SD.n=13.*P<0.05,**P<0.01vsnormal cell group;#P<0.05,##P<0.01vsAβ25-35group.

图6 各组HMGB1、RAGE、TLR4和NF-κB的蛋白水平比较

讨 论

人们一直认为Aβ沉积是导致AD的主要原因，但随着研究的深入，与 Aβ清除直接相关的MG逐渐被重视。在AD病程进展的不同阶段MG起到了不同的作用，在可见的Aβ形成之前MG的积聚是有益的，在AD的早期阶段MG起到了吞噬和清除Aβ的作用，从而保护大脑不受到Aβ的毒性损伤；随着病情的进展，MG对Aβ的清除能力逐渐下降[1]，大量Aβ沉积使MG活化并增殖，并过量释放NO、TNF-α、IL-6等促炎因子，介导神经细胞的炎症损伤。因此，MG在AD的病情发展中起到了至关重要的作用。本研究采用原代小胶质细胞建立AD模型，相较于细胞株更贴近体内环境，能更好地模拟AD，因此更具说服力及研究价值。

Figure 7.The releases of HMGB1, IL-1β and TNF-α in the culture supernatant in each group. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormal cell group;##P<0.01vsAβ25-35group.

图7 各组上清液中HMGB1、IL-1β和TNF-α浓度比较

AD中Aβ的重要形式是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ斑块中最主要的成分是Aβ1-42，它更易于聚集，有很强的神经毒性，Aβ1-40是Aβ主要的可溶性形式，主要存在于血液循环之中[6]。Aβ25-35被认为是Aβ1-42的活性片段，于37 ℃水浴箱孵育7 d左右，即为“聚集”状态。但目前关于小胶质细胞与Aβ相互作用的资料却甚少。我们的CCK-8实验结果显示一定时间内小胶质细胞活性随着Aβ25-35浓度增大而减小，24 h后无明显变化。故选择24 h为造模时间，Aβ的造模浓度为40 μmol/L。

近年来的研究表明，HMGB1可能在记忆损害相关性疾病、慢性神经退行性变疾病及进行性神经炎症相关疾病中发挥关键作用[2]。临床研究证明，AD 患者颞叶皮质中的HMGB1水平升高[3]。在脑室内注射 Aβ建立的 AD 动物模型中，脑室内注射HMGB1加剧神经元的死亡，并延迟淀粉样蛋白的清除[4]。离体细胞实验也表明，原代培养的MG同时加入 Aβ1-42和HMGB1，Aβ1-42在细胞表面聚集增加，HMGB1 抑制MG对 Aβ1-42的吞噬作用[3-4]。HMGB1 还抑制MG对 Aβ1-40的降解，延迟 Aβ1-40的清除。以上研究均表明HMGB1 在 AD 发病机制中可能发挥重要作用，但其具体的机制至今尚不明确。HMGB1引起的损伤是通过 TLR4 和 RAGE 两者共同介导的[7]。RAGE是最早被确定的HMGB受体，两者结合通过激活 Ras 或 p38MAPK、ERK1/2，最终激活 NF-κB[8-9]。HMGB1与 TLR4结合后激活 MyD88、IL-1 受体相关激酶、TNF 受体相关因子等使IκB磷酸化降解从而激活NF-κB[10-11]。NF-κB 过度活化诱导神经细胞、胶质细胞诸多炎症因子及酶的表达如 TNF-α、IL-1β、iNOS 等，导致炎症级联反应引起神经元凋亡[12]。本研究用Western blot法检测发现，与正常组小胶质细胞相比，Aβ25-35模型组HMGB1、RAGE、TLR4和NF-κB的表达显著升高，说明Aβ增加了HMGB1的表达，促进了NF-κB通路活化。

姜黄素作为一种香料被广泛用于食品中。研究发现姜黄素促进AD患者巨噬细胞吞噬Aβ[13]，破坏Aβ 纤维前体的稳定性[14]，并且减少Aβ诱导的氧自由基产物水平。本研究发现，姜黄素是一种抗炎药物，能抑制小胶质细胞释放炎症介质。但是姜黄素在AD中的具体抗炎机制目前还不明确。本研究条件下，与Aβ25-35模型组相比，Aβ25-35+Cur治疗组的HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κB的蛋白水平显著下降，提示姜黄素可能通过下调HMGB1的表达，抑制NF-κB信号通路来减弱小胶质细胞的炎症反应，从而对AD起到治疗作用。

总之，Aβ25-35可活化诱导大鼠原代小胶质细胞分泌IL-1β、TNF-α等炎症因子，姜黄素可减轻其细胞毒性和炎症反应，机制可能与下调HMGB1的表达，抑制NF-κB通路的促炎症反应有关。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Curcumin reduces neuroinflammation stimulated by Aβ25-35in primary rat microglial cells

LIU Xu-hua, WANG Xiao-qing, WANG Zhong-su, ZHAO Hang, QIAN Xiao-wei, CAO Hong, LI Jun

(DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:lijun0068@163.com)

AIM: To investigate the effects of curcumin (Cur) on the expression of High mobility group box 1 protein (HMGB1), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) in amyloid-β (Aβ)-induced primary rat microglial cells. METHODS: Microglia were derived from the cerebral cortices of postnatal rat brains. The cells were identified by immunocytochemistry using mouse anti rat Iba-1 monoclonal antibody. A cell model using primary rat microglial cells incubated with Aβ25-35as an inflammation model of Alzheimer’s disease (AD) was set up. The morphological characters of primary rat microglial cells were observed. The concentration of Aβ25-35and the treatment concentration of curcumin were selected by CCK-8 assay. Cultured primary rat microglial cells were divided into 5 groups: normal cell group, Aβ25-35group, Cur group, Aβ25-35+Cur group and Aβ25-35+DMSO group. The expression of HMGB1, NF-κB, and receptor for advanced glycation end products (RAGE) was detected by Western blot. The levels of HMGB1, IL-1β, and TNF-α in the culture supernatant were measured by ELISA. RESULTS: The purity of primary microglias determined by Iba-1 immunofluorescence was more than 95%. The protein levels of HMGB1, RAGE and NF-κB were significantly increased after Aβ25-35stimulation. After treatment with Cur, the protein levels of HMGB1, RAGE and NF-κB were significantly decreased (P<0.05). The levels of HMGB1, IL-1β and TNF-α in the supernatant were significantly increased after Aβ25-35stimulation. Cur significantly decreased the level of HMGB1, IL-1β and TNF-α in the supernatant. CONCLUSION: Curcumin significantly inhibits neuroinflammation stimulated by Aβ25-35in primary rat microglial cells.

Alzheimer’s disease; Curcumin; Amyloid-β; Microglial; High mobility group box 1 protein

杂志网址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1635- 07

2016- 01- 25

2016- 07- 01

国家自然科学基金资助项目(No. 81271204);浙江省科技厅公益项目(No. 2016C37098)

△通讯作者 Tel： 0577-88002925; E-mail： lijun0068@163.com

R363.2; R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.017