伊马替尼诱导原代T细胞凋亡作用机制研究①

陈小华　邱华云　施珊珊　吴　莎　林　晨　李扬秋

(韶关学院医学院，韶关512000)



伊马替尼诱导原代T细胞凋亡作用机制研究①

陈小华邱华云施珊珊②吴莎②林晨②李扬秋③

(韶关学院医学院，韶关512000)

目的：研究伊马替尼(IM)诱导正常人原代CD3+T细胞凋亡的分子机制。方法：0～100 nmol/L的IM作用原代T细胞24 h后,应用流式细胞术检测细胞凋亡情况；应用实时荧光定量PCR技术检测Caspase-3、Caspase-8、A20和NF-κB基因表达变化；应用Western blot技术检测A20和NF-κB蛋白表达变化。结果：IM具有明显促T细胞凋亡能力，其凋亡分子Caspase-3 和A20基因表达水平均上调，而NF-κB的基因和蛋白水平均下调。结论：IM通过上调A20的表达诱导了T细胞的凋亡。

伊马替尼；原代CD3+T细胞；TNF-α诱导蛋白3;核转录因子

慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一类髓系增生性血液肿瘤，染色体异常是CML的直接病因，由9、22号染色体转位而成并含有bcr/abl融合基因，该基因转录翻译为BCR/ABL融合蛋白，而该融合蛋白的靶向药物伊马替尼(Imatinib mesylate,IM)，是目前临床上用于治疗CML慢性期的一线药物[1,2]。但临床研究报道其具有抑制机体免疫功能的副作用，尤其是抑制T细胞的能力[2-4]。细胞免疫在抗肿瘤中发挥重要的作用，T细胞的凋亡活动与细胞内一系列信号分子的转导有关，如Caspase-3、Caspase-8、A20和NF-κB等[5]。

1　材料与方法

1.1材料1640培养基购自Gibco；小牛血清购自Hyclone；TRIzol购自康为世纪公司；伊马替尼购自Sigma；逆转录和荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo；细胞裂解液和BCA试剂盒购自凯基生物公司；A20抗体购自Abcam、NF-κB p65抗体购自CST；凋亡试剂盒购自联科生物公司；引物由上海生工公司合成。

1.2方法

1.2.1分离人外周血单个核细胞实验所需人外周血在征得本人同意后，采自5位正常人。步骤如下：静脉抽血10 ml，加到准备好的抗凝管中，混匀。将血液转移至50 ml离心管中，用PBS将血稀释一倍[6]。稀释好的血液沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液中，2 000 r/min水平离心×20 min。小心吸取单个核细胞至新离心管。PBS洗细胞2次，每次1 000 r/min×10 min。

1.2.2CD3+T细胞分选取得到的PBMCs细胞，应用MACS技术分选CD3+T:分离缓冲液(含2 mol/L EDTA和0.5%胎牛血清)洗涤PBMCs 2次，调整细胞悬液浓度为1×107个/ml；将悬浮细胞离心弃上清，按107个总细胞加入40 μl PBS缓冲液和10 μl CD3磁珠单抗，充分混匀，4 ℃孵育15～30 min；加入1 ml缓冲液混匀，1 500 r/min离心10 min，弃上清；加入500 μl缓冲液混匀配制细胞悬液；将500 μl缓冲液缓慢流过磁柱，冲洗磁柱一遍,500 μl总细胞悬液缓慢通过磁柱，收集非CD3+细胞，将500 μl缓冲液缓慢冲洗并收集流出液，重复洗涤2遍；将磁柱从磁座移开，更换离心管。将500 μl缓冲液加入磁柱，用推进器用力加压，收集CD3+T细胞。加入500 μl缓冲液重复洗涤2次，收集CD3+T细胞，将收集的CD3+T细胞计数。

表1实时荧光定量PCR引物

Tab.1Primers for Real-time fluorescence quantitative PCR

TargetAccessionNo.ForwardReverseLength(bp)β2mNMOL/L_004048.2TACACTGAATTCACCCCCACCATCCAATCCAAATGCGGCA145A20NMOL/L_001270508.1CTGGGACCATGGCACAACTCCGGAAGGTTCCATGGGATTC182NF-κBp65NMOL/L_001165412.1CCACAAGACAGAAGCTGAAGAGATACTATCTGTAAGTGAACC149Caspase-3NM_004346.3TCCTTTTCCTTTGACGCTACTTCCACCAACCAACCATTTCTTTA109Caspase-8NM_001080124.1GATTCAGAGGAGCAACCCTATTTCATCCCCAGCAGAAAGTCAG90

1.2.3细胞凋亡测定(Annexin V- PI双染)调整原代T细胞数量为4×106个/ml，细胞悬液加入24孔板中，每孔100 μl；IM刺激组(25～100 nmol/L)；SEA联合IM组：SEA(10 ng/ml)预处理4 h，接着IM处理24 h;同时设空白对照,每组设置三个复孔。37 ℃培养箱中培养24 h后，离心收集细胞。PBS洗一遍后重悬，送样，正常细胞分出200 μl不染色。1 000 r/min离心5 min离心弃上清，加200 μl Binding Buffer混匀。加5 μl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。离心弃上清，加200 μl Binding Buffer混匀后再染色，上机。

1.2.4RNA提取将原代T细胞置于完全培养液中，于恒温培养箱中培养。取对数期的原代T细胞离心、洗涤、细胞计数后，分别接种于24孔板中，每孔2 ml，含4 × 106个细胞。分组：50 nmol/L IM刺激原代T细胞组，阴性对照组。各组复孔。持续刺激24 h后，采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取RNA，并依据试剂盒说明书，用随机引物合成cDNA 第一链。

1.2.5实时荧光定量PCRβ2m、A20和NF-κB p65亚单位基因序列根据文献提取[7]，Caspase-3和Caspase-8则自己设计，见表1。反应体系为20 μl，其中含上下游引物浓度为0.3 μmol/L，cDNA 1.0 μl，去离子水12.8 μl ，MasterMix 10 μl。反应条件为预变性95℃ 3 min，扩增40个循环，每循环包括95℃变性1 min，60℃退火30 s，72℃，于68℃读板一次，最后以0.15℃/s的速度从55℃到95℃每隔1 s记录一次荧光值，获得融解曲线。所有反应均在Bio-Rad实时荧光定量PCR仪上进行[7]。

1.2.6相对定量分析采用相对定量法分析各组基因表达水平的差异，以β2m为内参对照，计算公式为相对表示量=2-ΔΔCt，其中Ct值为扩增曲线达到阈值所需循环数，ΔCt为组内目的基因与内参Ct值之差，ΔΔCt为组间ΔCt之差。2-ΔΔCt<1表示基因表达减少，2-ΔΔCt>1则表示基因表达增高。

1.2.7Western blot

1.2.7.1蛋白提取反应体系分为两组：对照组和IM 处理组，各组复孔，24 h后收集细胞并离心，加入200 μl细胞裂解液，置冰上裂解30 min，每隔10 min轻轻振荡1次,4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，保留上清，用BCA法测定样品蛋白浓度。

1.2.7.2SDS-PAGE电泳等量蛋白上样(50 μg)，10% SDS-PAGE电泳,采用半干转的方式将蛋白转移到PVDF膜上，将膜室温封闭30 min,PBST洗涤3次，每次10 min。将膜放入新配置一抗溶液中4 ℃过夜。PBST洗3次，每次10 min，将膜放入新配置二抗溶液中，室温下2～4 h，PBST洗3次，每次10 min，ECL室温显色。

2　结果

2.1IM对T细胞凋亡影响不同浓度的IM(10、50、100 nmol/L)刺激CD3+T细胞24 h后，利用Annexin V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示与对照组相比，50和100 nmol/L IM均可促进T细胞凋亡，而超抗原SEA则可抑制IM对T细胞的促凋亡作用，见图1。

图1　不同浓度IM刺激CD3+T细胞24 h的凋亡作用Fig.1　Apoptosis of CD3+T cells stimulated with different concentrations of IMNote: *.P<0.05 vs control;#.P<0.05.

图2　实时荧光定量基因融解曲线Fig.2　Real-time fluorescence quantitative PCR melt-ing curves

图3　实时荧光定量PCR产物鉴定Fig.3　Identification of RT-PCR products

2.2PCR产物的鉴定分析为了评估PCR反应的特异性，对各基因(Caspase-3、Caspase-8、A20、NF-κB p65亚单位、β2m)融解曲线进行分析，结果显示各基因分别在80.0℃、81.5℃、85.5℃、85.0℃和85.0℃均只有一个单峰(图2)。10 g/L琼脂糖电泳随机标本中Caspase-3、Caspase-8、A20、NF-κB p65亚单位和β2m，结果显示PCR产物片段大小分别为109、90、182、149和145 bp，说明PCR结果准确无误(图3)。

2.3对凋亡相关基因表达的影响5例正常人外周血CD3+T细胞，在50 nmol/L浓度IM作用下，Caspase-3 和A20基因的表达水平>1，表示两者基因表达均上调；NF-κB p65亚单位基因的表达水平<1，表示NF-κB p65亚单位基因表达下调，见图4。

图4　IM刺激T细胞24 h后基因表达情况Fig.4　Changes of gene expression after T cells stimulated by 50 nmol/L IMNote: *.P<0.05 vs control.

图5　50 nmol/L IM刺激T细胞24 h后NF-κB p65和A20蛋白表达情况Fig.5　NF-κB and A20 protein expression after stimulated by 50 nmol/L IM for 24 h

2.4 NF-κB p65亚单位 、A20蛋白表达的情况考虑NF-κB与凋亡的关联性，我们使用50 nmol/L浓度IM作用 T细胞24 h，与对照组相比，NF-κB p65亚单位蛋白的表达水平明显下调，而A20蛋白的表达水平明显上调，这与其基因表达变化一致，见图5。

3　讨论

实时荧光定量PCR技术是通过检测靶基因转录水平，间接反映目标蛋白表达的方法。尽管，近来有学者对该技术检测的结果提出质疑，但一直以来仍被许多实验室采用[8,9]。当然，实时荧光定量PCR技术只是初步观察变化情况，并不是唯一的观察指标，还需要结合其他方法加以佐证，如WB等。

IM因具有靶向抑制BCR/ABL激酶作用而作为临床治疗CML慢性期的一线药物，但临床使用的同时也发现其具有抑制患者免疫功能的作用，特别是抑制T细胞激活的能力[2-4]。有文献报道NF-κB信号通路与细胞的激活密切相关。毛细胞白血病(HCL)是一种罕见的慢性B细胞增生性疾病，Nagel等[10]报道不管是HCL细胞株还是HCL病人的样本中，NF-κB通路均被异常激活，导致了B细胞的持续增生和凋亡抑制。Wei等[11]也发现SQSTM1基因存在于自噬缺陷的肿瘤细胞中，SQSTM1代偿性地激活NF-κB信号通路促进了肿瘤细胞的生长。

NF-κB信号通路参与炎症反应，与凋亡途径密切相关。细胞凋亡涉及一系列蛋白，如Caspase家族蛋白、p53蛋白和Bcl-2家族蛋白、Survivin，其中Caspase 家族蛋白分为三大类：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎症介导因子，构成了级联放大效应[12]。其中Caspase-8为凋亡启动因子，能在其它蛋白辅助下发生自我活化并激活下游的Caspase。Caspase-3为凋亡执行因子，作用于其特异性底物并导致细胞凋亡，是凋亡进入不可逆阶段的标志。NF-κB具有抗细胞凋亡作用被许多文献报道，李淑莲等[13]发现在mDRA-6诱导白血病Jurkat细胞凋亡过程中激活了NF-κB，而激活的NF-κB能够抑制其诱导凋亡的能力，表明NF-κB具有抗细胞凋亡作用。化疗药物TMZ在治疗胶质母细胞瘤过程中产生耐药性，Chen等[14]研究其耐药发生的机制，发现肿瘤的周期性缺氧(Cycling hypoxia)通过激活ROS介导的NF-κB，诱导Bcl-xL的表达，促进了肿瘤细胞的抗凋亡作用，从而产生对化疗药物的耐药性[14]。

免疫应答中，抗原与TCR结合后募集下游信号分子形成了CARMA1-BCL10-MALT1(CBM)复合物，此复合物募集泛素连接酶TRAF6，TRAF6对IKKγ泛素结合位点进行泛素化，从而激活了下游IκB激酶(IKK)复合物和NF-κB，NF-κB进入核内指导相关炎性细胞因子基因表达,合成释放TNF-α、IL-1、IL-2等，表现出T细胞激活增殖。在有关信号通路途径中，针对相关的蛋白激酶，或转录因子的检测基本是在基因水平、蛋白水平或自身蛋白的磷酸化层面上。三者之间的变化关系，既有同步变化的报道也有不同步报道。如Ko[15]报道氧化铜纳米粒子作用人上皮细胞可以上调MAPK的表达，而MAPK抑制剂可以下调MAPK的表达，均表现出基因水平、蛋白水平以及自身蛋白磷酸化水平的同步变化[15]。而Gao[16]发现电针刺激后五组小鼠NR2B基因、蛋白水平没有显著差异，但其中有两组小鼠NR2B磷酸化水平有显著差异。这也表明靶基因、靶蛋白与靶蛋白磷酸化水平表达变化也可以不同步。不过，尚未见有文献报道：仅靶基因、蛋白表达水平的变化而无靶蛋白自身磷酸化的改变。因此，本研究通过检测NF-κB基因和蛋白水平的变化情况，间接地说明伊马替尼可以通过TCR-CBM复合物-NF-κB-凋亡途径诱导T细胞的凋亡。

已有的研究表明[5]，A20最初是作为TNF-α诱导内皮细胞反应中的一个诱导性蛋白而鉴定，是一个重要的NF-κB负调控因子。A20为具有去泛素化酶功能，通过抑制泛素连接酶TRAF6对IKKγ泛素化，抑制了IKK复合物的激活，从而达到抑制NF-κB转录因子的功能[17]。A20本身不具备促细胞凋亡的能力，而是通过抑制NF-κB的抗凋亡作用，间接表现其促凋亡效应。A20表达过低或失活会导致NF-κB持续活化，致使多种疾病的发生。临床上已经发现多种淋巴瘤中存在A20缺失[17,18]。Chen等[19]对143例临床肝癌病人标本研究发现，A20的表达与肿瘤大小呈负相关，且A20高表达的病人具有更长的无病生存期，无论是体内还是体外实验均表明：促进A20的表达均可抑制肝癌细胞的增殖和转移，而敲除A20基因则正好相反，因此，A20可作为肝癌病人预后的新指标和潜在的治疗靶点[19]。

我们的实验结果表明，IM作用正常人外周血CD3+T细胞后，具有诱导T细胞凋亡的效应(图1)。实时荧光定量结果显示Caspase-3和A20基因表达上调，NF-κB基因表达下调；Western blot结果与实时荧光定量结果变化一致(图4、5)。我们推测，IM诱导T细胞凋亡的作用机制是IM可能经TCR途径，作用于上游负反馈蛋白A20，通过增强A20蛋白的功能，抑制下游P65蛋白的表达，进而抑制下游NF-κB转录因子的活性，促进T细胞凋亡效应。此外，我们的实验发现，超抗原SEA能够拮抗IM对T细胞凋亡诱导的作用(图1)，也佐证了IM对T细胞抑制的机制。当然，也可能在这条信号通路中A20并非IM作用的唯一靶点。因此，还需要进一步实验研究证实。

综上所述，IM能够通过上调A20分子的表达，通过NF-κB信号途径诱导T细胞的凋亡，这不利于清除白血病残余细胞。因此，如何逆转IM对T细胞的抑制作用值得深入研究。

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[收稿2016-02-26修回2016-04-08]

(编辑许四平)

Mechanisms of imatinib mesylate induced apoptosis of primary T cells

CHEN Xiao-Hua,QIU Hua-Yun,SHI Shan-Shan,WU Sha,LIN Chen,LI Yang-Qiu.

Medical College of Shaoguan University，Shaoguan 512000，China

Objective:To investigate mechanism of imatinib mesylate induced apoptosis of primary CD3+T cells．Methods: The CD3+T cells were stimulated by 0-100 nmol/L imatinib for 24 h，cell apoptosis was detected by flow cytometry;Caspase-3,Caspase-8,A20 and NF-κB expression levels were detected by Real-time quantitative PCR and Western blot.Results: IM significantly increased apoptosis of T cell;Caspase-3 and A20 gene expression levels were upregulated and NF-κB expression level was downregulated both in gene and protein levels.Conclusion: IM increased apoptosis of T cell by upregulating A20 expression.

Imatinib mesylate;Primary CD3+T cells;A20；NF-κB

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.005

陈小华(1987年- )，男，硕士，助教，主要从事分子免疫学方面的研究，E-mail: 627489541@qq.com。

及指导教师：林晨(1961年-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事白血病发病机制的研究，E-mail: tlinc@jnu.edu.cn。

R364．1+4

A

1000-484X(2016)09-1268-05

①本文受国家自然科学基金(91129720)和广东省科技计划(国际合作)项目(2012B050600023)资助。

②暨南大学医学院微生物与免疫学系，广州510632。

③暨南大学医学院血液病研究所，广州510632。