IL-10基因多态性与溃疡性结肠炎易感性的关系及对临床预后的影响

沈　凤　李德中

(攀钢集团总医院，攀枝花617000)



IL-10基因多态性与溃疡性结肠炎易感性的关系及对临床预后的影响

沈凤李德中

(攀钢集团总医院，攀枝花617000)

目的：探讨IL-10多态位点的基因多态性与溃疡性结肠炎的易感性及对临床预后的影响。方法：采用病例-对照研究设计，选取80例溃疡性结肠炎患者作为病例组，另外选性别和年龄匹配的健康受试者作为对照组。所有患者治疗前抽取空腹静脉血并提取DNA，设计-819 T/C(rs1800871)、-592 A/C(rs1800872)、-1082 G/A(rs1800896)PCR引物进行PCR扩增，扩增产物酶切后进行琼脂糖凝胶电泳以确定基因类型，采用Logistic回归计算校正相对危险度(OR)和95%置信区间(95%CI)评价基因多态性与溃疡性结肠炎的易感性，并分析对临床预后的影响。结果：(1)病例组患者IL-10多态位点rs1800896基因类型AA、GG和AG分布频率与对照组受试者差异具有统计学意义(P<0.01)；(2)与rs1800896基因型AA比较，基因型为GG的患者溃疡性结肠炎危险性显著升高(P<0.01)，并且临床缓解率显著降低(P<0.01)；(3)病例组患者IL-10多态位点rs1800871基因类型CC、CT和TT分布频率与对照组受试者差异无统计学意义(P>0.05)；(4)病例组患者IL-10多态位点rs1800872基因类型AA、AC和CC分布频率与对照组受试者差异无统计学意义(P>0.05)。结论：IL-10多态位点rs1800896基因类型GG可增加溃疡性结肠炎的易感性，并且显著降低患者的临床预后。

溃疡性结肠炎；基因多态性；白介素-10；临床预后；相关性

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是临床常见胃肠道疾病，病因尚不明确，属临床难治病之一[1]。溃疡性结肠炎多发于20～40岁青年人群，因其病程漫长，常反复发作，并可能癌变，给患者带来生理及心理上的巨大压力。近年来我国溃疡性结肠炎发病有升高趋势，其患病率为11.6/105[2]。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是疾病易感性差异的遗传基础，作为常见的遗传标志已被广泛应用于各种疾病的发病风险及预后评价的相关性研究。白介素-10(Interleukin-10，IL-10)是一种Th2型细胞因子，对所有促炎性细胞因子从合成到释放几乎都有抑制作用。研究显示IL-10的分泌水平受其基因多态性的影响，并且不同人群IL-10多态性的分布存在差异[3，4]。IL-10基因启动子区域存在多个单核苷酸多态性位点，其中-819T/C(rs1800871)、-592 A/C(rs1800872)、-1082G/A(rs1800896)与IL-10基因的转录活性及血浆IL-10水平有关[5]。目前IL-10基因多态性与溃疡性结肠炎的易感性和临床预后却鲜有报告。本文探讨IL-10基因多态性与溃疡性结肠炎易感性和临床预后的关系，进一步阐明溃疡性结肠炎发病的遗传学机制。

1　资料与方法

1.1一般资料选择本院2013年1月至2014年12月就诊的80例患者纳入本次研究作为病例组。患者纳入标准如下：(1)年龄≥18周岁；(2)《我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》 中溃疡性结肠炎诊断标准[6]；(3)疾病程度为轻度或者中度；(4)均签署知情同意书。排除标准：(1)放射性结肠炎及有癌变倾向的溃疡性结肠炎患者；(2)合并严重心脏、肝脏、肾脏和造血系统等功能障碍的患者；(3)特异性感染性结肠炎；(4)研究者认为其他不适于参加本研究的患者。同时按照年龄和性别配比原则，选择同期在本院接受健康体检的80例非溃疡性结肠炎患者作为对照组。病例组患者中男性患者49例(61.25%)，女性31例(38.75%)；年龄范围19～67岁，平均年龄为(37.56±9.14)岁；病程0.5～15年，平均(7.47±4.52)年；轻度患者41例(51.25%)，中度患者39例(48.75%)；初诊患者12例(15.00%)，复发患者68例(85.00%)。对照组患者中男性患者47例(58.75%)，女性33例(41.25%)；年龄范围19～67岁，平均年龄为(38.35±8.75)岁。两组受试者的年龄和性别差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1DNA模板的制备早晨抽取空腹静脉血2 ml于EDTA抗凝管中，按照说明书DNA提取试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)提取DNA，将制备的DNA模板于-80℃ 保存备用。

1.2.2PCR扩增根据dbSNP数据库(www.ncbi. nlm.nih.gov/SNP)提供的IL-10的SNP信息，选择rs1800871、rs1800872和rs1800896作为候选SNP，应用Primer 3.0 软件设计rs1800871、rs1800872和rs1800896 PCR的引物。引物和内切酶均由上海科华生物工程股份有限公司合成，各引物序列、内切酶和产物长度序列见表1。反应体系共50 μl： 10×PCR Buffer 5 μl，dNTP 1 μl(10 μmol/L)，模板1 μl，上游和下游引物各 1 μl， 2 U/μl Taq DNA聚合酶(含Mg2+)0.5 μl，加入蒸馏水至50 μl。使用美国PTC-220 PCR扩增仪(美国MJ Research公司)进行扩增，PCR 反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，退火55℃ 45 s，72℃ 60 s，反应35个循环，72℃延展10 min。取5 μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳20 min，确定扩增产物为所需要的扩增片段，则进行酶切试验。

1.2.3酶切产物检测及分析rs1800872和rs1800896 PCR扩增产物由限制性内切酶于37℃温育24 h进行酶切， rs1800871 PCR扩增产物由限制性内切酶于55℃温育24 h进行酶切。酶切体系为10 μl：限制性内切酶5 U 1× buffer 1 μl，PCR产物4 μl，加蒸馏水至10 μl。酶切后于2%的琼脂糖凝胶上电泳25 min后进行凝胶成像分析。rs1800871的基因型分别为CC型(84和125 bp)、TT型(209 bp)和CT型(84、125和209 bp)，rs1800872的基因型分别为AA型(176和236 bp)、CC型(412 bp)和AC(176、236和412 bp)，rs1800896的基因型分别为AA型(97和280 bp)、GG型(27、97和253 bp)和AG型(27、97、253和280 bp)。

1.3统计学分析数据分析使用SPSS17.0软件。以χ2检验和t检验比较病例组和对照组人口学特征，采用χ2检验比较病例组与对照组基因型分布频率的差异。对照组的基因型分布采用拟合优度检验进行Hardy-Weinberg平衡检验，多因素Logistic回归计算OR值及其95%CI以表示相对危险度。采用χ2检验和t检验分析不同基因多态性患者临床疗效的差异。

表1IL-10基因启动子3个位点的引物序列及PCR产物长度

Tab.1Primer sequence of 3 gene promoter loci of IL-10 and length of PCR products

PolymorphismlociPrimersequenceRestrictionenzymeProductlengthrs1800871F:5'-TCATTCTATGTGCTGGAGATGG-3'R:5'-TGGGGGAAGTGGCTAAGAGT-3'EcoNI377rs1800872F:5'-CCTAGGTCACAGCGTGG-3'R:5'-GGTGAGCACTACCTGACTAGC-3'RsaI412rs1800896F:5'-CCAAGACAACACTACTAAGGCTCCTTT-3'R:5'-GCTTCTTATATGCTAGTCAGGTA-3'Maem209

2　结果

2.1IL-10 rs1800871基因多态性对溃疡性结肠炎易感性的分析IL-10 rs1800871基因PCR扩增产物酶切电泳结果见图1。病例组和对照组IL-10多态位点rs1800871的基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。病例组患者IL-10多态位点rs1800871基因类型CC、CT和TT分布频率分别为53.75%、40.00%和6.25%，而对照组受试者分别为56.25%、38.75%和5.00%，差异无统计学意义(χ2=0.1724，P=0.917)，见表2。

2.2IL-10 rs1800872基因多态性对溃疡性结肠炎易感性的分析IL-10 rs1800872基因PCR扩增产物酶切电泳结果见图2。病例组和对照组IL-10多态位点rs1800872的基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。病例组患者IL-10多态位点rs1800872基因类型AA、AC和CC分布频率分别为7.5%、51.25%和41.25%，而对照组受试者分别为10.00%、50.00%和40.00%，差异无统计学意义(χ2=0.313，P=0.855)，见表3。

图1　IL-10 rs1800871基因PCR扩增产物酶切电泳结果Fig.1　Enzyme digestion results of PCR products on rs1800871 of IL-10Note: 1.DNA marker；2.CC genotype；3.TT genotype；4.CT genotype.

表2IL-10多态位点rs1800871基因多态性与溃疡性结肠炎的关系(n=80)

Tab.2Relationship of polymorphic loci rs1800871 and ulcerative colitis(n=80)

GenetypePatientgroup[n(%)]Controlgroup[n(%)]CC43(53.75)45(56.25)CT32(40.00)31(38.75)TT5(6.25)4(5.00)

2.3IL-10 rs1800896基因多态性对溃疡性结肠炎易感性的分析IL-10 rs1800896基因PCR扩增产物酶切电泳结果见图3。病例组和对照组IL-10多态位点rs1800896的基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。病例组患者IL-10多态位点rs1800896基因类型AA、GG和AG分布频率分别为66.25%、30.00%和3.75%，而对照组受试者分别为40.00%、55.00%和5.00%，差异具有统计学意义(χ2=11.213，P=0.004)。多因素Logistic回归分析，调整年龄、性别、病程、疾病程度、初复诊情况等变量后，与rs2294008基因型AA比较，基因型为GG的患者溃疡性结肠炎危险性显著升高(P<0.01)，基因型为AG的患者溃疡性结肠炎危险性差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.4溃疡性结肠炎的治疗及疗效评价所有溃疡性结肠炎患者口服美沙拉秦肠溶片1.0 g/次，3次/d，疗程为8周。记录所有患者治疗前及治疗8周时的Sutherland DAI评分[7]，DAI评分<2分为症状缓解。经治疗后缓解57例(71.25%)，其余23例(28.75%)均未缓解。与rs1800896基因型AA患者比较，与IL-10多态位点rs1800896基因类型GG的患者临床缓解率显著降低(P<0.01)，见表5。

图2　IL-10 rs1800872基因PCR扩增产物酶切电泳结果Fig.2　Enzyme digestion results of PCR products on rs1800872 of IL-10Note: 1.DNA marker；2.AA genotype；3.CC genotype；4.AC genotype.

表3IL-10多态位点rs1800872基因多态性与溃疡性结肠炎的关系(n=80)

Tab.3Relationship of polymorphic loci rs1800872 and ulcerative colitis(n=80)

GenetypePatientgroup[n(%)]Controlgroup[n(%)]AA6(7.5)8(10.00)AC41(51.25)40(50.00)CC33(41.25)32(40.00)

图3　IL-10 rs1800896基因PCR扩增产物酶切电泳结果Fig.3　Enzyme digestion results of PCR products on rs1800896 of IL-10Note: 1.DNA marker；2.AA genotype；3.GG genotype；4.AG genotype.

表4IL-10多态位点rs1800896基因多态性与溃疡性结肠炎的关系(n=80)

Tab.4Relationship of polymorphic loci rs1800896 and ulcerative colitis(n=80)

GenetypePatientgroup[n(%)]Controlgroup[n(%)]OR(95%CI)PAA24(30.00)44(55.00)1-GG53(66.25)32(40.00)4.373(2.546-7.639)<0.01AG3(3.75)4(5.00)1.748(0.895-3.418)0.275

表5IL-10多态位点rs1800896基因多态性对溃疡性结肠炎患者临床缓解率的影响[n(%)]

Tab.5Effect of polymorphic loci rs1800896 to clinal remission rate in ulcerative colitis[n(%)]

GenetypeClinicalremissionrate(n=57)Non-clinicalremissionrate(n=23)χ2PAA(n=24)23(95.83)1(4.17)10.9970.001GG(n=53)31(58.49)22(41.51)--AG(n=3)3(100.00)0(0.00)3.0510.008

3　讨论

溃疡性结肠炎是一种多因素致病的结直肠慢性非特异性炎症性疾病，是消化系统常见病和多发病。溃疡性结肠炎的发病率在欧美发达国家最高且较为稳定[7]，近年来亚洲等低发地区的发病率呈现逐年增高趋势[8]。我国溃疡性结肠炎的发病率在近20 年间上升至11.6/10 万，并且以慢性反复发作型患者为主[9]。溃疡性结肠炎病程长、迁延不愈，在临床治疗中缺乏有效用药指征，目前尚无有效的治愈方法，治疗目标主要是早期控制发作及长期维持缓解[10]。目前治疗溃疡性结肠炎多以氨基水杨酸类药物如美沙拉秦为主，病情严重采用肾上腺皮质激素及免疫抑制剂进行治疗。

机体免疫系统失衡后细胞因子可激活各种炎症细胞，从而最终导致肠组织的慢性炎症性反应。因此，细胞因子可能参与溃疡性结肠炎的发生。IL-10是同型二聚体细胞因子，属于长链细胞因子家族，IL-10也是重要的抗炎因子，由单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞等分泌[11]。IL-10主要通过与其配体IL-10R 结合，阻止炎症性细胞因子的分泌，调节T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等的分化和增殖[12]，参与抑制炎症反应、免疫调节作用和抗感染活性[13-16]。IL-10基因位于染色体1q31-1q32区域，含有5个外显子和4个内含子，总长度为4 700 bp[17]。已有研究显示，IL-10R 基因多态性与乙型肝炎病毒感染慢性化、幽门螺杆菌相关胃癌和首发精神分裂症等疾病易感性有关[18-20]。

本研究结果显示，病例组患者IL-10多态位点rs1800896基因类型AA、GG和AG分布频率和对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。多因素Logistic回归分析，与rs2294008基因型AA比较，基因型为GG患者溃疡性结肠炎危险性显著升高(P<0.01)，说明IL-10多态位点rs2294008基因型GG可增加溃疡性结肠炎的风险。分析IL-10多态位点rs2294008基因型对溃疡性结肠炎患者的临床预后，结果显示IL-10多态位点rs1800896基因类型GG的患者临床缓解率显著降低(P<0.01)，说明IL-10多态位点rs1800896基因类型GG可显著降低溃疡性结肠炎的临床预后。病例组患者IL-10多态位点rs1800871(CC、CT和TT)和rs1800872的基因分型(AA、AC和CC)分布频率和对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。关于IL-10基因多态性与溃疡性结肠炎易感性的研究结果之间也存在差异。然而根据荟萃分析结果[21]显示，IL-10多态位点-819 C/T(rs1800871)和-592 C/A(rs1800872)基因多态性与溃疡性结肠炎的易感性有关，而-1082 A/G(rs2294008)与溃疡性结肠炎的易感性无关。但是该荟萃分析纳入患者主要为白种人。由于人种不同， 也可能导致IL-10多态位点rs1800871、rs1800872和rs1800896与溃疡性结肠炎的易感性结果不同，这可能是本研究结果与荟萃分析结果不一致的原因之一。

总之，本研究结果显示，IL-10多态位点rs1800896基因类型GG可增加溃疡性结肠炎的易感性，并且显著降低患者的临床预后。

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[收稿2015-11-26修回2016-04-01]

(编辑张晓舟)

IL-10 gene polymorphism with ulcerative colitis susceptibility and its influence on clinical outcomes

SHEN Feng,LI De-Zhong.

General Hospital of Panzhihua,Iron & Steel Ltd,Panzhihua 617023,China

Objective:To study the correllation of genetic polymorphisms of IL-10 polymorphic loci with ulcerative colitis susceptibility and its influence on clinical outcomes.Methods: A total of 80 patients with ulcerative colitis were selected as case group and the others by sex and age matched healthy subjects as control group according to the case-control study design.Peripheral venous blood samples were drawn and DNA was extracted from all subjects prior to treatment.PCR primers of -819T/C(rs1800871),-592A/C(rs1800872),-1082G/A(rs1800896) were designed for PCR amplification.The fragments produced from human genomic DNA were performed by restriction enzyme digestion of amplified PCR products,and further separated using agarose gel electrophoresis.Relative risk(OR) and 95% confidence interval(95% CI) were calculated by the Logistic regression,in order to evaluate the correlation of IL-10 gene polymorphism with susceptibility of ulcerative colitis and clinical outcomes.Results: (1)The distribution frequency of genotype AA,GG and AG of polymorphic loci rs1800896 in cases patients were significantly different from that in control group(P<0.01).(2)Compared to rs1800896 genotype AA,genotype GG were significantly associated with increased risk for ulcerative colitis(P<0.01)and the decreased clinical remission rate(P< 0.01).(3)The distribution frequency of genotype CC,CT and TT of polymorphic loci rs1800871 were not significantly different between groups(P>0.05).(4)The distribution frequency of genotype AA,AC and CC of polymorphic loci rs1800872 were not significantly different between groups(P>0.05).Conclusion: IL-10 polymorphic loci rs1800896 genotype GG would be associated with increased susceptibility to ulcerative colitis,and poor prognosis of patients.

Ulcerative colitis; Genetic polymorphism; Interleukin-10; Clinical outcomes;Correlation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.028

沈凤(1969年-)，女，副主任医师，主要从事消化内科的研究。

R574.62

A

1000-484X(2016)09-1369-05