中国广西人群miR-146a、miR-149 基因遗传多态性的研究①

罗宏成　王春芳　雷　茗　韦　颖　谭　昙　韦叶生

(右江民族医学院附属医院检验科，百色533000)



中国广西人群miR-146a、miR-149 基因遗传多态性的研究①

罗宏成王春芳雷茗韦颖谭昙韦叶生

(右江民族医学院附属医院检验科，百色533000)

目的：研究广西人群miR-146a C>G (rs2910164)、miR-149 T>C(rs2292832)等位基因及基因型频率分布，分析其与不同民族种族间的差异性。方法：采用单碱基延伸技术和DNA测序技术对303例广西人群中miR-146a C>G和miR-149 T>C基因单核苷酸多态性(SNP)位点进行分型检测，并与人类基因组计划 (Hapmap) 数据库中公布的非洲人、欧洲人、日本人和中国北京人群的SNP分型数据比较。结果：miR-146a C>G、miR-149 T>C等位基因和基因型频率在广西男女人群之间分布均无差异性(P均>0.05)。广西人群miR-146a C>G和miR-149 T>C基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、中国北京人比较有统计学意义(P均<0.05)。结论：广西人群miR-146a C>G和miR-149 T>C存在基因多态性，与其他种族人群比较有差异性，这种差异性对人类遗传病的研究可能会起到重要作用。

miR-146a；miR-149；单核苷酸多态性；种族

微小核糖核酸 (miRNAs) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链小RNA 分子。miRNAs主要通过碱基互补配对到靶基因信使RNA(mRNA)的3′非编码区(3′UTRs),部分降解或者抑制靶基因的翻译表达和稳定性[1]。miRNAs参与细胞增殖、分化、发育、凋亡和代谢等多种生物学行为[2]。位于前体miRNA(pre-miRNAs)或成熟miRNA中的单核苷酸多态性(SNP)可影响成熟miRNAs的形成和表达水平，从而可能影响疾病的发生、发展和转化。最近存在于2个前体miRNAs的单核苷酸多态性序列(miR-146a C>G[rs2910164;chromosome 5,159912418],miR-149T>C[rs2292 832;chromosome 2,241395503])被发现参与多种疾病的发病机制[3-6]，但研究有关miR-146a、miR-149 基因多态性在广西人群与其他民族种族的分布比较未见文献报道。本研究拟采用单碱基延伸PCR和DNA基因测序技术对303例广西人群miR-146a、miR-149基因多态性进行检测研究，旨在为认识基因多态性在人类遗传性疾病病因及发病机制的研究提供理论基础。

1　对象与方法

1.1实验对象随机选择2014年1月至2015年12月来右江民族医学院附属医院体检的无血缘关系的健康人群303 例，其中男性181例，女性122例,年龄21～ 89岁，临床实验室各检查指标均正常，排除严重感染、心脑血管疾病及肿瘤的体检者。

1.2实验方法

1.2.1 基因组DNA提取采集健康体检者静脉血3 ml，用EDTA-K2抗凝；采用深圳亚能公司全血DNA提取试剂盒，严格按照说明书提取全血基因组DNA，-70℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成根据NCBI中Genebank基因库包含人miR-146a C>G (rs2910164)、miR-149 T>C(rs2292832)两个SNP位点的全长序列，用在线软件primer3.0设计引物，引物由生工生物工程有限公司合成。miR-146a C>G(rs2910164)的上游引物序列为：5′-AGGAAGCAGCTGCATTGGATTT-3′，下游引物序列为：5′-GTCCTCAAGCCCACGATGACAG-3′，延伸引物序列为：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTGGGTTGTGTCAGTGTCAGAC-CT-3′；miR-149 T>C(rs2292832)的上游引物序列为：5′-TCTGGCTCCGTGTCTTCACTCC-3′，下游引物序列为：5′-GGCCCGAAACACCCGTAAGATA-3′，延伸引物序列为：5′-TTTTTTTTCGGCGACCTGCG-TTGTTCC-3′。

1.2.3 PCR扩增反应体系miR-146a C>G(rs2910164)、miR-149 T>C(rs2292832)两个SNP位点的PCR扩增反应体系均是20 μl，体系包含有PCR缓冲液1×GC buffer Ⅰ(TaKaRa)2 μl，2.5 mmol/L Mg2+2.0 μl，0.2 mmol/L dNTP 2.0 μl，0.2 μmol/L上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μl，若体积不足20 μl用灭菌双蒸水补足。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，8 μl的PCR产物经0.5 U虾碱酶(SAP)(Promega) 和4 U外切酶Ⅰ(EXO Ⅰ)(Epicentre)纯化后，再用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit技术于37℃孵育60 min，紧接着75℃孵育15 min进行延伸反应，延伸产物用虾碱酶(SAP)纯化后用ABI3730XL测序仪电泳测序。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbios-ystems)来分析。PCR反应条件为：95℃ 2 min;(94℃ 20 s,65℃ 40 s,72℃ 1 min)循环11次，(94℃ 20 s,59℃ 30 s,72 ℃ 1 min)循环24次;72℃ 2 min;4℃维持冷却。

1.3统计学分析根据实验结果采用SPSS13.0统计软件包进行分析，miR-146a和miR-149基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，采用χ2检验比较各组间基因型及等位基因频率，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-146a C>G、miR-149 T>C基因型检测结果miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因均具有多态性，其PCR扩增产物的片段大小分别为：215 bp和261 bp。miR-146a C>G基因SNP检测结果有GG、GC、CC三种基因型；miR-149 T>C基因有CC、CT、TT三种基因型。基因测序仪ABI3730测序证实我们的检测结果(见图1、2)。

2.2miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因多态性在广西健康人群中的分布miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因型和等位基因频率，经χ2检验，所有基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，样本来源具有群体代表性。两个多态性位点基因型和等位基因频率在广西人群男女之间比较均无统计学差异(χ2分别为0.269、0.040和0.085、0.014，P均>0.05)，miR-146a C>G基因以GC杂合子基因型多见，占45.9%，等位基因C多见，占62.2%。miR-149 T>C基因以CT杂合子基因型多见，占44.9%，等位基因T多见，占62.4%。见表1、2。

2.3miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因在不同种族人群间的比较miR-146a C>G 、miR-149 T>C基因多态性分布频率分别与人类基因组计划(HapMap)公布非洲人、欧洲人、日本人和中国北京人四个人群的SNP 分型数据进行比较。广西人群miR-146a C>G多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、中国北京人比较差异有统计学意义(χ2分别为29.09、135.97、13.24和29.81、155.21、14.55；P均<0.05)，但与日本人比较差异无统计学意义(χ2分别为5.65和0.08；P均>0.05)。miR-149 T>C多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、中国北京人比较差异有统计学意义(χ2分别为92.27、111.40、7.09和100.91、127.00、5.11；P均<0.05)，但与日本人比较差异无统计学意义(χ2分别为0.876和0.003；P均>0.05)。见表3、4。

图1　miR-146a C>G (rs2910164)测序图Fig.1　Sequenceing diagram of miR-146a C>G(rs29101-64) polymorphismNote: A.GG genotype;B.CG genotype;C.CC genotype. Gene mutations are indicated by the arrows.

图2　miR-149 T>C(rs2292832)测序图Fig.2　Sequencing diagram of miR-149 T>C(rs2292-832) polymorphismNote: A.TT genotype;B.CT genotype;C.CC genotype.Gene mutations are indicated by the arrows.

表1广西人群miR-146a C>G(rs2910164)基因型和等位基因频率分布比较

Tab.1Distribution of allele and genotype frequencies of miR-146a C>G(rs2910164)in Guangxi population

GroupsCasesGenotypesfrequencyGGGCCCAllelefrequencyGCMale18127(14.9%)85(47.0%)69(38.1%)13(38.4%)22(61.6%)Female12218(14.8%)54(44.3%)50(41.0%)90(36.9%)154(63.1%)Total30345(14.9%)13(45.9%)11(39.3%)22(37.8%)377(62.2%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-146a C>G polymorphism were not different between male and female group(P>0.05).

表2不同地区民族及种族miR-146a C>G(rs2910164)基因多态性频率分布比较

Tab.2Comparison of frequency distribution of miR-146a C>G(rs2910164) polymorphism among different regions of nationalities and ethnic groups

GroupsCasesGenotypesfrequencyGGGCCCAllelefrequencyGCAfrican1)22674(32.7%)100(44.2%)52(23.0%)248(54.9%)204(45.1%)European1)226134(59.3%)78(34.5%)14(6.2%)346(76.5%)106(23.5%)Japanese17218(10.5%)98(57.0%)56(32.6%)134(39.0%)210(61.0%)Pekingman1)8624(27.9%)44(51.2%)18(20.9%)92(53.5%)80(46.5%)Guangxipeople30345(14.9%)139(45.9%)119(39.3%)229(37.8%)377(62.2%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-146a C>G polymorphism were significantly difference among European, African and People in Beijing by compared with Guangxi population,1)P<0.05.

表3广西人群miR-149 T>C(rs2292832)基因型和等位基因频率分布比较

Tab.3Distribution of allele and genotype frequencies of miR-149 T>C(rs2292832) in Guangxi population

GroupsCasesGenotypesfrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTMale18127(14.9%)81(44.8%)73(40.3%)13(37.3%)227(62.7%)Female12219(15.6%)55(45.1%)48(39.3%)93(38.1%)151(61.9%)Total30346(15.2%)136(44.9%)121(39.9%)22(37.6%)378(62.4%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-149 T>C polymorphsim were not different between male and female group(P>0.05).

表4不同地区民族及种族miR-149 T>C(rs2292832)基因多态性频率分布比较

Tab.4Comparison of frequency distribution of miR-149 T>C(rs2292832) polymorphism among different regions of nationalities and ethnic groups

GroupsCasesGenotypesfrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTAfrican1)226106(46.9%)100(44.2%)20(8.8%)312(69.0%)140(31.0%)European1)222122(55.0%)80(36.0%)20(9.0%)324(73.0%)120(27.0%)Japanese17222(12.8%)84(48.8%)66(38.4%)128(37.2%)216(62.8%)Pekingman1)864(4.7%)40(46.5%)42(48.8%)48(27.9%)124(72.1%)Guangxipeople3034(15.2%)13(44.9%)12(39.9%)22(37.6%)37(62.4%)

Note：The frequencies of allele and genotype of miR-149 T>C polymorphism were significantly difference among European, African and People in Beijing by compared with Guangxi population,1)P<0.05.

3　讨论

microRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA(前体miRNA)，长度大约为300～1 000个碱基，pri-miRNA经过一次加工后，成为pre-miRNA即microRNA前体，长度大约为70～90个碱基，pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20～24 nt的成熟miRNA。成熟miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥重要作用，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可能有多个靶基因，而几个miRNA也可同时调节同一个靶基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达，miRNA调节着人类三分之一的基因，备受科学研究人员的关注。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorp-hism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，与种族差异、疾病易感性及药物反应差异有关。研究发现，位于前体(miR-146a)的杂合子G/C单核苷酸多态性会导致miR-146a表达异常，从而导致肿瘤的发生、发展[7]。miR-149(rs2292832)基因多态性与中国汉族人群类风湿性关节炎、甲状腺癌、肝细胞癌有相关性[8-10]。因此有必要研究miR-146a 和miR-149 基因多态性在广西人群的遗传学分布特征，为深入研究相同疾病在广西人群的发病率奠定基础。

本实验采用单碱基延伸PCR技术和DNA测序技术对303例广西健康人群miR-146a 和miR-149 基因多态性进行检测研究，统计其各自基因型和等位基因分布情况。分析结果表明，miR-146a 和miR-149 均存在基因多态性，miR-146a C>G (rs2910164)有GG、GC、CC三种基因型，以GC杂合子基因型多见，占45.9%，等位基因C多见，占62.2%。miR-149 T>C(rs2292832)存在CC、CT、TT三种基因型，以CT杂合子多见，占44.9%，T等位基因多见，占62.4%。miR-146a 和miR-149 基因在广西健康男女人群中基因型和等位基因分布均无差异(χ2分别为0.269、0.040和0.085、0.014，P均>0.05)，说明这两个位点基因多态性与性别没有关系。miR-146a C>G多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、中国北京人比较有统计学差异(χ2分别为29.09、135.97、13.24和29.81、155.21、14.55；P均<0.05)，但与日本人比较无统计学差异(χ2分别为5.65和0.08；P均>0.05)，miR-146a等位基因C(62.2%)频率高于非洲人(45.1%)、欧洲人(23.5%)、日本人(61.0%)、北京人(46.5%)，这种差异可能与不同民族种族生活环境和饮食习惯有关。miR-149 T>C多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、中国北京人比较有统计学差异(χ2分别为92.27、111.40、7.09和100.91、127.00、5.11；P均<0.05)。miR-149等位基因T(62.4%)与同是亚洲人群的日本人等位基因T(62.8%)和北京人等位基因T(72.1%)比例相近，但与非洲人等位基因T(31.0%)和欧洲人等位基因T(27.0%)相差甚远，这可能与种族亲缘性有关。

以上研究表明，广西健康人群miR-146a和 miR-149基因型及等位基因与其他民族种族存在差异性，正确分析各基因多态性的分布特点，为研究miR-146a 和miR-149 基因多态性相关疾病的发病机制以及疾病的防治提供科学有效的途径，也为人类学和群体遗传学的研究提供基础理论知识。研究虽然发现广西健康人群miR-146a和 miR-149存在基因多态性，与其他种族人群比较存在差异性，但研究仍存在局限性，如研究的样本量仍不充足，广西健康人群各民族是否有差异，也没能联系某种疾病模型来分析基因多态性与其发病率的关系，如何深入研究miR-146a和 miR-149基因多态性存在于不同种族人群中的机制，是今后我们努力研究的方向。

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[收稿2015-12-17修回2016-01-08]

(编辑倪鹏)

Study of genetic polymorphisms of miR-146a ,miR-149 gene in Guangxi population

LUO Hong-Cheng,WANG Chun-Fang,LEI Ming，WEI Ying，TAN Tan，WEI Ye-Sheng.

Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000,China

Objective:To study the frequencies of allele and genotype distribution of miR-146a C>G(rs2910164) and miR-149 T>C(rs2292832) gene, and to analyze the statistical differences between different racial and nationalities.Methods: The Polymerase Chain Reaction-Single Base Extension (PCR-SBE) technique and DNA sequencing methods were used for the determination of the SNP in miR-146a C>G and miR-149 T>C gene，and compared with the European, African, Japanese and People in Beijing from the Human Genome Project (HapMap).Results: There were no statistical differences of allele and genotype distribution in miR-146a C>G,miR-149 T>C between female and male group (P>0.05).There were significant difference frequencies of allele and genotype distribution of miR-146a C>G and miR-149 T>C gene by compared with the European, African and People in Beijing(P<0.05).Conclusion: There were gene Polymorphisms of miR-146a C>G and miR-149 T>C in Guangxi populations, and there were significant differences by compared with other ethnic populations, which may play an important role in the human inherited disease research.

miR-146a;miR-149;SNP;Ethnic

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.008

罗宏成(1985年-),男，硕士，主要从事临床检验诊断学方面研究，E-mail:513223727@qq.com。

及指导教师：韦叶生(1969年-)，男，博士，教授，主要从事分子生物学和免疫学检验方面研究，E-mail:wysh22@163.com。

R394.5

A

1000-484X(2016)09-1282-04

①本文为国家自然科学基金资助项目(81560552,81060243)。