黑骨藤抗急性痛风性关节炎的实验研究①

党荣敏　刘元忠　谢洪书　姚文琴　余跃生

(黔南民族医学高等专科学校,都匀558000)



黑骨藤抗急性痛风性关节炎的实验研究①

党荣敏刘元忠谢洪书姚文琴余跃生

(黔南民族医学高等专科学校,都匀558000)

目的：探讨黑骨藤在急性痛风性关节炎中的治疗效果。方法：健康雄性SD大鼠60只，随机等分为空白对照组(NC组)、模型组(M组)、秋水仙碱组(C组)、黑骨藤高剂量组(HD组)、黑骨藤中剂量组(MD组)和黑骨藤低剂量组(LD组)。除空白对照组外，其余大鼠均采用尿酸钠制备大鼠痛风性关节炎模型，用秋水仙碱(阳性对照)和不同剂量的黑骨藤灌胃给药治疗。治疗3、5、7 d后观察各组大鼠关节肿胀情况。治疗7 d后处死大鼠，取踝关节组织进行病理学检查，应用ELISA检测各组大鼠外周血中IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的表达。结果：黑骨藤干预组大鼠踝关节肿胀程度明显低于模型组，且治疗7 d后黑骨藤高剂量组疗效显著高于低剂量组(P<0.05)；与模型组相比，黑骨藤治疗组均有较少的炎细胞浸润，且黑骨藤高剂量组趋于正常对照组；黑骨藤干预组炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平显著低于模型组，呈剂量依赖性。结论：黑骨藤在大鼠急性痛风性关节炎中具有很好的治疗效果，且呈剂量依赖性，其机制可能与黑骨藤降低急性痛风性关节炎大鼠血清炎症因子表达有关。

黑骨藤；急性痛风性；关节炎

痛风是由于嘌呤代谢紊乱而引起的一种关节及软组织炎症性疾病[1]。嘌呤代谢紊乱致使尿酸大量生成，尿酸盐产生的结晶沉积在关节内导致产生了无菌性关节炎，且研究发现炎性细胞因子参与了痛风性关节炎的发生[2，3]。因此，抑制炎症反应可能成为治疗痛风性关节炎的潜在靶点。黑骨藤(Periploca forrestii schhr)的苗药名为蛙莽塞(贵州黔南州)，俗称黑骨头，具有舒筋活络，祛风除湿，消炎解毒，镇痛之功效[4,5]。而以往对于黑骨藤的研究主要集中于风湿、类风湿等方面，而其对痛风性关节炎的作用不明。基于此，本实验探讨了黑骨藤在急性痛风性关节炎中的治疗作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与药物雄性SD大鼠60只，体重180～200 g，均处于10～13周龄，由第三军医大学动物中心提供。黑骨藤采自贵阳市郊香纸沟，由贵阳医学院生药室鉴定并进行提取，用80%的乙醇回流提取，共提取3次，合并提取液，定性滤纸过滤后置60℃水浴蒸干，得到的提取物置冰箱保存备用。秋水仙碱片，由云南西双版纳版纳药业有限责任公司生产，批号H53021369。使用前用蒸馏水稀释成0.003 mg/ml[6]。尿酸钠结晶，美国Sigma公司生产，5 g/瓶，批号：120K5305。吐温80，天津市富宁精细化工有限公司生产，批号：101020。

1.1.2仪器和试剂超净工作台Sw-GJ-IF型(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；XJ-70 型电子分析天平DF-110型(常熟衡器工业公司)；酶标仪(mindty MR-96A)；IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2实验方法

1.2.1实验动物分组将60只SD大鼠编成1～60号，饲养3 d后，采用随机数字法分为6组，每组10只，分别是空白对照组、模型组、秋水仙碱组、苗药黑骨藤高、中、低剂量组。实验中均分笼饲养，自由摄食，自然光照并定期清洁、消毒。

1.2.2造模与实验干预除空白对照组外，其他各组均用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰卧固定，用6号注射针右侧踝关节后侧30℃～40℃方向插入至跟腱内侧，将0.2 ml尿酸钠溶液(50 mg/ml)注入关节腔内；空白对照组则将0.2 ml生理盐水注入关节腔内。秋水仙碱治疗组给予9 mg/kg每天灌胃，连续7 d；黑骨藤高、中、低剂量治疗组分别给100、50、25 mg/kg黑骨藤醇提取物灌胃，连续7 d；空白对照组和模型对照组给予等体积生理盐水每天灌胃，连续7 d。以上各组给药体积相等，每组大鼠每天上午9点灌胃，每天一次。

1.2.3大鼠关节肿胀程度造模前1 h及造模后2 h观察关节肿胀度，以后每天灌胃前测量大鼠关节肿胀度，连续测量7 d，并计算肿胀度，采用2 cm试纸，配合游标卡尺测量踝关节周径，关节肿胀程度(%)=(关节周径-初始周径)/初始周径×100%。分数越高，肿胀程度越高[7]。

1.2.4病理组织形态学观察每组10只大鼠，在第7天灌胃2 h后处死大鼠，取踝关节组织标本，采用4%多聚甲醛固定，4%盐酸脱钙后使用梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋：切片厚度4 μm，置于干净载玻片上，60%恒温箱中孵育4 h，脱蜡后苏木精染色10 min。流水冲洗1 min，1%盐酸乙醇分化5 s，待颜色由蓝色变为红色后，蒸馏水冲洗6 min。用1%的伊红染色5 s，酒精脱水后采用二甲苯透明，晾干，封片，在显微镜下观察。

1.2.5IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平测定每组10只大鼠，在第7天灌胃2 h后股动脉取血，3 000 r/min离心15 min，取上清液，ELISA检测IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的表达。实验步骤按相关ELISA试剂盒说明书操作。

2　结果

2.1各组大鼠不同时间的踝关节肿胀度注射尿酸钠后，模型鼠大鼠关节肿胀增加，于造模1 d后达到高峰，各组模型鼠与造模前相比，均有显著性差异(P<0.001)见图1A。治疗5 d后，与模型组相比，秋水仙碱组(P<0.01)和黑骨藤大剂量组均有显著性差异(P<0.05)。治疗7 d后，与模型组相比，黑骨藤高剂量组(P<0.01)、中剂量组(P<0.05)、低剂量组(P<0.05)均有显著性差异，且黑骨藤高剂量组疗效显著强于低剂量组(P<0.05)，图1B。

图1　各组大鼠关节肿胀程度Fig.1　Swelling dimension of joints among different groupNote: A.vs before model establishment，***.P<0.001；B.vs M group，*.P<0.05，**.P<0.01.

图2　大鼠踝关节病理组织学观察结果(HE,×200)Fig.2　Pathological examination in ankle joint among different group(HE,×200)Note: A.NC group;B.M group;C.C group;D.HD group;E.MD group;F.LD group.

表1各组IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α表达量比较

Tab.1Comparison of IL-1β,IL-6,IL-8 and TNF-α expression among different group

GroupsIL-1β(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-8(ng/ml)TNF-α(ng/ml)NCgroup22.12±4.40123.56±4.8949.33±5.53126.76±5.88Mgroup43.32±3.101)243.49±9.121)176.45±6.981)175.35±6.281)Cgroup27.43±1.304)134.34±5.223)52.17±5.473)138.23±3.763)HDgroup26.87±2.123)146.12±6.343)78.19±7.123)142.21±3.673)MDgroup37.56±5.912)156.23±10.122)168.54±6.16154.87±3.912)LDgroup41.32±3.10204.33±21.322)170.23±8.27171.21±8.45

Note：vs NC group,1)P<0.001;vs M group,2)P<0.05,3)P<0.01,4)P<0.001.

2.2各组大鼠踝关节病理情况空白对照组大鼠关节，滑膜细胞排列规则，周围软组织未见炎细胞浸润；模型组滑膜细胞增生，表面充血水肿，明显见炎细胞浸润；秋水仙碱组滑膜细胞基本正常，少量炎性细胞浸润；黑骨藤高剂量组滑膜细胞略有增生，周围软组织充血水肿不明显，见少量炎细胞浸润；黑骨藤中，低剂量组滑膜细胞轻度水肿，周围软组织充血水肿，少量炎细胞浸润，见图2。

2.3各组大鼠血清炎症因子水平检测从表1可以看出，与模型组相比秋水仙碱可以显著降低血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达(P<0.001)；黑骨藤大剂量组、中剂量组、低剂量组与模型组相比也均有显著性差异(P<0.05)，表明黑骨藤各个剂量组均有不同程度地降低血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达。

3　讨论

痛风是一种严重影响人类健康的代谢性关节炎性疾病。基于痛风大鼠的组织病理学与人类痛风极其相似，因而临床常用痛风大鼠作为研究治疗痛风用药的典型模型。秋水仙碱是治疗急性痛风关节炎发生的常用药物，其能够抑制关节发炎部位白细胞的聚集，消减尿酸结晶的堆积，减轻病变部位炎症反应，故本研究选取秋水仙碱作为阳性对照药物。

模型组在注射尿酸钠1 d后，足肿胀明显，提示造模成功。大剂量黑骨藤治疗组在用药5 d后，关节肿胀程度得到显著改善，且黑骨藤各剂量组的痛风大鼠在治疗1周后，关节肿胀得到了不同程度改善，并呈现剂量依赖性。这些研究初步证明了黑骨藤对急性痛风有一定的防治作用，且呈现量效关系。关节的炎性病变为痛风性关节炎的典型表现，本实验进一步研究发现，黑骨藤治疗组大鼠踝关节炎性细胞浸润明显减少，且呈现剂量依赖性，从而进一步证实，黑骨藤对痛风性关节炎有显著的治疗效果。且相关研究发现，黑骨藤在抗类风湿性关节炎、细胞免疫抑制和止痛方面也有很好的疗效[8-10]，提示黑骨藤或许可以作为一种治疗关节炎性病变的常规用药。

研究表明，炎性细胞因子与痛风性关节炎有着密切的关系[11]，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性细胞因子在关节炎性疾病中大量存在且作用广泛，在形成关节的炎症和骨关节的损伤等过程中发挥着重要作用。与该研究结果相似，本实验发现，与空白对照组相比，模型组大鼠外周血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α显著升高，进一步证实这些炎性细胞因子参与了痛风性关节炎的发生。因此，抑制这些炎性细胞因子的合成和释放，必能在一定程度上抑制痛风性关节炎的进展，改善相关症状。而本实验证实，与模型组相比，黑骨藤干预组大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达显著降低，且呈现剂量依赖性。提示，黑骨藤可能通过抑制炎性细胞因子的释放来改善痛风大鼠踝关节的肿胀程度，从而对抗痛风性关节炎的发生。然而具体机理有待于进一步的研究。

综上所述，黑骨藤在大鼠急性痛风性关节炎中具有很好的治疗效果，且呈剂量依赖性，其机制可能与黑骨藤降低痛风大鼠血清相关炎症因子表达有关，本研究为黑骨藤用于痛风的治疗提供了实验依据。

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[收稿2015-11-30修回2015-12-21]

(编辑许四平)

Experimental study on treatment of acute gout arthritis with periploca forrestii schltr

DANG Rong-Min,LIU Yuan-Zhong,XIE Hong-Shu,YAO Wen-Qin，YU Yue-Sheng.

Qiannan Medical College for Nationalities,Douyun 558000,China

Objective:To investigate the effects of periploca forrestii schltr in the treatment of acute gout arthritis.Methods: 60 healthy male SD rats were equally randomly divided into 6 groups:normal control group(NC),model group(M group),colchicine group(C group),high doses group of periploca forrestii schltr(HD group),middle doses group of periploca forrestii schltr(MD group) and low doses group of periploca forrestii schltr(LD group).Except the normal control group,model of gouty arthritis was induced in other groups by uric acid salt,colchicine(positive control) and different dose of periploca forrestii schltr were given by intragastric ad ministration.Swelling dimension of joints were observed at 3,5,7 days after treatment.All rats were killed after 7 days of treatment and ankle joint tissue was taken for pathological examination and the peripheral blood of rats was prepared for detecting the expression of interleukin 1β(IL-1β),IL-6,IL-8 and tumor necrosis factor(TNF-α) using enzyme linked immunosorbent test(ELISA).Results: The ankle joint swelling of periploca forrestii schltr group was significantly lower than that in the model group,and the effect of high doses group was much better than the low doses group after 7 days treatment(P<0.05);compared with model group,the inflammatory cells of each treatment groups were decreased and high doses group did not differ from that of normal control group;the levels of IL-1β,IL-6,IL-8 and TNF-α in periploca forrestii schltr group were dramatically lower than those in the model group in a dose-dependent manner.Conclusion: Periploca forrestii schltr has good therapeutic effect in rats with acute gouty arthritis and shows a dose-dependent response,and the mechanism may relate to the inhibition of inflammatory cytokines expression.

Periploca forrestii schltr;Acute gouty;Arthritis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.011

党荣敏(1976年-)，女，讲师，主要从事病原微生物学和免疫学教学等方面研究。

及指导教师：余跃生(1966年-)，男，教授，主要从事体质人类学教学等方面研究，E-mail:yuysheng00@sina.com。

R285.5

A

1000-484X(2016)09-1295-04

①本文为贵州省厅校联合自然科学类项目(gzwkj2013-2-003)和黔南科技计划项目(2013-3号)。