Rv0652蛋白对膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖与凋亡的影响

杨江华，杨国良，潘麒，薄隽杰

(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200217)



Rv0652蛋白对膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖与凋亡的影响

杨江华，杨国良，潘麒，薄隽杰

(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200217)

目的观察结核杆菌属PE_PGRS蛋白家族成员Rv0652对膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖与凋亡的影响。方法 在96孔板中接种膀胱癌T24、J82、RT4细胞悬液，每孔100 μL，含相应膀胱癌细胞5 000个。设空白组、Rv0652蛋白组和卡介苗组，分别加入DMEM培养液100 μL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培养液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培养液，12、24、36、48 h采用CCK-8试剂盒测定OD值，计算细胞增殖率。另取膀胱癌T24、J82、RT4细胞接种于10 cm培养皿中，设空白组、Rv0652蛋白组和卡介苗组，分别加入DMEM培养液10 mL、含体外重组Rv0652 10 μg/mL的DMEM培养液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培养液，培养24 h后采用PI和FITC- Annexin V双染色，流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果 随着培养时间延长，Rv0652蛋白组、卡介苗组膀胱癌细胞RT4、J82、T24增殖率逐渐下降(P均<0.05)；相同培养时间Rv0652蛋白组、卡介苗组细胞增殖率相比，P均>0.05。Rv0652蛋白组、卡介苗组RT4、J82、T24细胞凋亡率均高于对照组(P均<0.05)；Rv0652蛋白组、卡介苗组相比，P均>0.05。结论 Rv0652蛋白能抑制膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖，诱导细胞凋亡，效果与卡介苗类似。

膀胱癌；膀胱癌细胞；Rv0652蛋白；卡介苗；细胞增殖；细胞凋亡

膀胱内灌注化疗药物(如吉西他滨、吡柔比星、丝裂霉素等)或免疫治疗药物(如卡介苗)有助于降低经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)后非肌层浸润性膀胱癌的复发率[1，2]，但仍有30%的患者术后经卡介苗膀胱灌注治疗无效，70%接受卡介苗膀胱灌注治疗的患者会发生不良反应[3，4]。Rv0652蛋白是从结核分枝杆菌中分离出的蛋白，是结核杆菌PE_PGRS蛋白家族成员[5]。Rv0652蛋白在活动性结核患者体内能诱导很强的抗体反应，同时可激活巨噬细胞，诱导TNF及MCP-1生成[6]。Rv0652还能通过结合Toll样受体4(TLR4)诱导树突状细胞分化成熟，产生TNF、IL-6等炎症因子，激活MyD88和TRIF信号通路[7,8]。这些信号通路及细胞因子均与膀胱癌的发生发展有关。故我们推测Rv0652有可能产生与卡介苗类似的抗膀胱肿瘤效应。2015年9月～2016年3月，我们观察了Rv0652蛋白对膀胱癌细胞T24、J82、RT4增殖与凋亡的影响，并与卡介苗进行比较，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验细胞与材料膀胱癌细胞系T24、J82、RT4购自上海国标生物科技有限公司。CCK8试剂盒购自日本同仁公司；PI-AnnexinV购自美国BD公司；DMEM培养液和胰蛋白酶购自Gibco公司，青霉素、链霉素购自Hyclone公司；ELISA试剂盒购自美国BD公司。膀胱灌注用卡介苗购自日本伯川公司。Rv0652蛋白采用文献[4]方法获取。

1.2Rv0652蛋白、卡介苗对膀胱癌细胞增殖的影响观察采用CCK8法。在96孔板中接种膀胱癌T24、J82、RT4细胞悬液，每孔100 μL，含相应膀胱癌细胞5 000个。将培养板放在培养箱预培养；细胞贴壁后，更换培养液。设空白组、Rv0652蛋白组和卡介苗组，分别加入DMEM培养液100 μL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培养液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培养液，分别于12、24、36、48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液继续培养2 h，用酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度值(OD值)。每个检测点设3个复孔。计算Rv0652蛋白组和卡介苗组细胞增殖率。细胞增殖率=(处理组OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%。

1.3Rv0652蛋白、卡介苗对膀胱癌细胞凋亡的影响观察采用PI-AnnexinV法。膀胱癌T24、J82、RT4细胞接种于10 cm培养皿中。设空白组、Rv0652蛋白组和卡介苗组，分别加入DMEM培养液10 mL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培养液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培养液，于培养箱中培养24 h。用PI和FITC- Annexin V双染色，然后用流式细胞仪观察细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

2　结果

2.1Rv0652蛋白组、卡介苗组细胞增殖率比较随着培养时间延长，Rv0652蛋白组、卡介苗组RT4、J82、T24细胞增殖率逐渐下降(P均<0.05)；相同培养时间Rv0652蛋白组、卡介苗组细胞增殖率差异无统计学意义。详见表1。

表1　不同培养时间Rv0652蛋白组、卡介苗组的膀胱癌RT4、J82、T24细胞增殖率比较

注：与同组同类细胞培养12 h相比，*P<0.05；与同组同类细胞培养24 h相比，#P<0.05；与同组同类细胞培养36 h相比，△P<0.05。

2.2各组细胞凋亡率比较Rv0652蛋白组、卡介苗组RT4、J82、T24细胞凋亡率均高于对照组(P均<0.05)；Rv0652蛋白组、卡介苗组相比，P均>0.05。详见表2。

表2　各组细胞凋亡率比较

注：与对照组同类细胞相比，*P<0.05。

3　讨论

在我国，膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，其主要诊断和治疗手段是TURBT术，但膀胱肿瘤术后复发率超过50%，一部分患者会进展至肌层浸润性膀胱癌[7]。为了减少膀胱癌的术后复发，临床推荐患者术后进行膀胱灌注治疗[8]。其中卡介苗是高危非肌层浸润性膀胱癌治疗的首选药物[9]。已有研究[10]表明，卡介苗可抑制膀胱癌细胞增殖，同时促进膀胱肿瘤细胞凋亡，然而卡介苗是减毒活菌制剂，不良反应较多[11,12]。卡介苗治疗的全身不良反应有发热、全身不适、结核菌败血症、肺部结核感染、肝脏毒性、全身皮疹等[13,14]；局部不良反应有化学性膀胱炎、尿频、膀胱挛缩、肉芽肿性前列腺炎等[15，16]。上述不良反应限制了卡介苗在膀胱癌治疗中的临床应用。

Rv0652蛋白是从结核分枝杆菌中分离出的蛋白，是结核杆菌PE_PGRS蛋白家族成员之一。结核杆菌PE蛋白家族这是一组富含甘氨酸和丙氨酸的酸性蛋白家族，它们的氨基末端附近都含有脯氨酸-谷氨酸基序。该家族蛋白质编码基因包含称为PGRS的多拷贝串联重复序列，在基因组中成簇散在分布。PE家族的PGRS片段与EB病毒的EB病毒核抗原1(EBNA-1)序列具有明显同源性。已有研究[4]表明Rv0652可通过TLR4和MyD88激活巨噬细胞，诱导巨噬细胞成熟，促进巨噬细胞分泌炎症因子，其中包括TNF和MCP-1。此外，Rv0652被TLR4识别后可诱导树突状细胞成熟分化，促进TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的释放[6]。Rv0652还可能激活Fas/FasL途径引起细胞凋亡。我们推测Rv0652可抑制膀胱癌细胞增殖和凋亡。本研究结果显示，随着培养时间延长，Rv0652蛋白组、卡介苗组RT4、J82、T24细胞增殖率逐渐下降；Rv0652蛋白组、卡介苗组RT4、J82、T24细胞凋亡率均高于对照组。本研究结果印证了上述猜测。

Rv0652蛋白抑制膀胱癌细胞增殖、诱导膀胱癌细胞凋亡可能涉及多种机制。一方面，Rv0652作为单体蛋白质可直接结合细胞膜，影响膜流动性，从而影响细胞活力。同时Rv0652与膀胱癌细胞系T24、J82、RT4结合后，激活Fas/FasL通路，引起Caspase-8的活化，从而引起膀胱癌细胞凋亡。此外，Rv0652可通过结合TLR4诱导大量炎症因子释放，包括TNF-α等，可能激活依赖TNF-α的凋亡信号通路来诱导细胞凋亡。Rv0652抑制膀胱癌细胞系增殖、促进膀胱癌细胞凋亡的效果与卡介苗类似，而且Rv0652作为单体蛋白质，不具有卡介苗完整的菌体，可以减小卡介苗引起的全身感染的发生风险，避免了卡介苗的不良反应，值得参考应用。

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国家自然科学基金资助项目(81372188)。

薄隽杰(E-mail: renjibojj@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.011

R737.14

A

1002-266X(2016)31-0037-03

2016-04-15)