转染lncRNA Gm15638的小鼠肾小球系膜细胞中FN、Col Ⅰ表达变化

王苏雨，王敏，姚迪，卢春，陆卫平

(1南京医科大学附属淮安第一医院，江苏淮安223300；2南京医科大学)



·基础研究·

转染lncRNA Gm15638的小鼠肾小球系膜细胞中FN、Col Ⅰ表达变化

王苏雨1，王敏1，姚迪1，卢春2，陆卫平1

(1南京医科大学附属淮安第一医院，江苏淮安223300；2南京医科大学)

目的观察转染长链非编码RNA(lncRNA)Gm15638的小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES13中纤维化标志物纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)的表达变化。方法 采用PCR法扩增lncRNA Gm15638片段，并将其插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体，构建重组慢病毒载体pCDH-Gm15638。用转染试剂将重组目的质粒pCDH-Gm15638与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞，收集重组慢病毒悬液，测定病毒滴度。将SV40-MES13细胞分为实验组和对照组，分别转染pCDH-Gm15638和慢病毒空载体pCDH-Mock。转染48 h后采用real-time PCR法检测Gm15638验证pCDH-Gm15638转染情况；提取细胞总蛋白，采用Western blotting法检测FN、Col Ⅰ。结果 双酶切鉴定和测序结果显示，重组慢病毒载体pCDH-Gm15638构建成功。通过三质粒包装获得重组慢病毒，测得病毒滴度约6×107efu/mL。实验组、对照组细胞中Gm15638相对表达量分别为867、1，两组相比，P<0.05。实验组细胞中FN、Col Ⅰ相对表达量分别为0.739、1.08，对照组分别为0.48、0.845，两组相比，P均<0.05。结论 转染Gm15638的SV40-MES13细胞中纤维化标志物FN、Col Ⅰ表达水平下调。

长链非编码RNA；肾小球系膜细胞；纤维连接蛋白；Ⅰ型胶原蛋白；糖尿病肾病

长链非编码RNA(lncRNA)是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于真核生物中[1～4]。目前研究表明lncRNA参与细胞周期、细胞凋亡、细胞代谢等活动，并广泛参与机体生理和病理过程，是多种疾病诊断及治疗潜在的靶点[5]，但关于lncRNA与糖尿病肾病关系的研究较少。糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症，糖尿病肾病早期病理改变为肾脏增大，随后有系膜细胞增生、系膜基质增多、肾小球基底膜增厚，最后可出现肾小球硬化[6]。糖尿病肾病的发生机制十分复杂[7,8]。本课题组前期通过lncRNA芯片对糖尿病肾病小鼠和正常小鼠的肾组织进行检查，发现糖尿病肾病小鼠肾组织中lncRNA Gm15638表达明显下调。为进一步探讨Gm15638在糖尿病肾病发生发展过程中的作用，本实验构建了表达Gm15638的重组慢病毒载体并转染小鼠肾小球系膜细胞，观察细胞中纤维化标志物纤维边接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)的表达变化，现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料慢病毒表达系统由包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP三种质粒构成，所用的小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES13及293T细胞均在5% CO2、37 ℃培养箱中培养，分别生长在含有5%、10%灭活胎牛血清的DMEM中，均加入青霉素和链霉素。相关PCR引物由南京锐真科技有限公司合成；PCR酶、限制性内切酶Nhe Ⅰ、BamH Ⅰ与SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司；T4连接酶购自南京诺唯赞科技有限公司；质粒小提试剂盒、切胶纯化试剂盒购自美国Omega公司；质粒转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；增强化学发光试剂购自美国Cell Signaling Technology公司；抗FN单克隆抗体、抗Col Ⅰ单克隆抗体、抗Tubulin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司。

1.2重组质粒pCDH-Gm15638的构建及鉴定根据Ensembl的基因序列，分别设计Gm15638序列的上下游引物，PCR扩增出Gm15638序列全长，核酸电泳验证PCR产物并切胶回收。用限制性内切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和Gm15638的PCR扩增产物，酶切产物经核酸电泳切胶回收，回收产物与载体pCDH连接后转化入感受态细胞大肠埃希菌DH5α，随机挑选氨苄西林抗性的单克隆进行大量扩增，提取出重组质粒pCDH-Gm15638进行双酶切鉴定、基因测序。用LipofectamineTM2000将包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G与目的质粒pCDH-Gm15638共同转染入293T细胞，同时以慢病毒空载体(pCDH-Mock)作阴性对照。转染48 h后在荧光显微镜下观察到有大约90%的细胞出现明显绿色荧光，收集含病毒颗粒的细胞上清液，离心并过滤病毒液。通过荧光计数法测定病毒滴度。

1.3重组质粒pCDH-Gm15638转染SV40-MES13细胞用pCDH-Gm15638和pCDH-Mock分别转染SV40-MES13细胞(分别为实验组与对照组)，48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。分别提取RNA并用real-time PCR法检测Gm15638，以β-actin为内参，反应条件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40个循环。

1.4SV40-MES13中FN、Col Ⅰ检测分别提取实验组和对照组细胞总蛋白，采用Western blotting法检测FN、Col Ⅰ，以Tubulin蛋白为内参。用Image J图像分析系统软件计算条带灰度值，代表蛋白相对表达量。

1.5统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Gm15638质粒的构建及鉴定结果构建pCDH-Gm15638质粒后进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后在7 742 bp和489 bp处出现2条特异性条带(图1)，说明长为489 bp的基因已成功克隆至慢病毒载体中。质粒送测序后经软件比对，插入的489 bp片段与Ensembl基因库中序列一致，表明重组质粒pCDH-Gm15638构建成功。将包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2与目的质粒pCDH-Gm15638共同转染293T细胞，以转染pCDH-Mock的293T细胞作阴性对照，病毒滴度分别1×108、6×107efu/mL。

2.2重组质粒pCDH-Gm15638转染SV40-MES13细胞情况两组转染后48 h荧光显微镜下观察到绿色荧光表达，阳性率为80%。实验组与对照组细胞中Gm15638相对表达量分别为867、1，两组相比，P<0.05。

2.3转染pCDH-Gm15638后SV40-MES13细胞中FN、Col Ⅰ表达比较实验组细胞中FN、Col Ⅰ相对表达量分别为0.739、1.08，对照组细胞中FN、Col Ⅰ相对表达量分别为0.48、0.845，两组相比，P均<0.05。见图2。

注：M为DNA标准参照物；1为Gm15638质粒的双酶切产物;2为重组质粒pCDH-Gm15638的双酶切产物。

图1重组质粒pCDH-Gm15638的双酶切鉴定结果

图2　转染pCDH-Gm15638后SV40-MES13细胞中FN、Col Ⅰ表达比较

3　讨论

非编码RNA(ncRNA)是不被翻译成蛋白质的RNA的统称，根据其功能分为持家ncRNA和调控ncRNA，持家ncRNA主要包含tRNA、rRNA、核内小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)，调控ncRNA包含lnc RNA和短链非编码RNA[9]。lncRNA广泛存在于生物体内，包括内含子、基因间转录本及双向重叠的转录本，广泛参与机体生理和病理过程。lncRNA可从表观遗传学、转录调控及转录后调控等参与基因的调控。目前，lncRNA的研究还主要集中在其表达差异的检测，明确功能的lncRNA相对较少，对其作用机制的研究尚处于起步阶段。

糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症中最为严重的一种，如治疗不及时，可导致终末期肾小球病变、肾衰竭，造成肾脏不可逆性损伤[10]。该病发病机制十分复杂，高血糖引起的代谢通路异常、多元醇代谢通路、氧化应激、晚期糖基化终末产物增多、炎症介质水平增高等都可能是其发病原因，但具体机制尚未完全阐明，治疗效果也并不理想[15]。糖尿病肾病的典型病理变化是肾小球硬化，组织学特点是基底膜增厚、细胞外基质堆积和肾小管基质纤维化，而基底膜主要是由胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖构成，因此，纤维化和胶原蛋白增多可能是糖尿病肾病发生的重要因素[11,12]。

新近研究表明，ncRNA通过异常表达、甲基化、基因多态性等多种途径在糖尿病的发病过程中起重要作用[16]。Alvarez等[17]研究表明，高糖状态下LncRNA-PVTI能上调肾系膜细胞中纤溶酶原激活物抑制因子和转化因子的表达，从而导致肾小球中细胞外基质积聚，FN-1水平增高。有学者[18]发现，lncRNA ANRIL可通过抑制胰岛素依赖性蛋白激酶抑制因子2B的表达，引起P15INK4B基因低表达而导致糖尿病。Ravassard等[19]发现，HI-LNC25是一种胰岛特异性lncRNA，能够调控与糖尿病发生相关的蛋白编码基因如GLIS家族锌指3(GLIS3)的表达。糖尿病是导致动脉粥样硬化的危险因素，Wu等[20]研究显示，lincRNA-p21可通过调控p53信号转导通路抑制血管平滑肌细胞和巨噬细胞的增殖、诱导凋亡，从而减少动脉粥样硬化的发生。

Gm15638属于基因间lncRNA，定位于4号染色体。本实验成功构建了Gm15638表达质粒，成功构建了慢病毒，并转染SV40-MES13细胞，发现SV40-MES13细胞中FN、Col Ⅰ表达下调，提示上调Gm15638表达可能有助于降低肾小球系膜细胞纤维化指标水平，延缓纤维化。我们猜测，Gm15638可能通过调控下游靶蛋白等途径发挥作用，具体的调控机制仍有待进一步研究。

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江苏省卫生厅科研项目(H201458)。

陆卫平(E-mail: hyhalwp@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.008

R692.6

A

1002-266X(2016)31-0028-03

2016-05-12)