胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ、神经纤毛蛋白2的表达变化及其意义

王凯，连海峰，牛琼，贾兴芳，刘成霞

(滨州医学院附属医院，山东滨州256600)



胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ、神经纤毛蛋白2的表达变化及其意义

王凯，连海峰，牛琼，贾兴芳，刘成霞

(滨州医学院附属医院，山东滨州256600)

目的观察胃癌组织中鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)和神经纤毛蛋白2(NRP2)的表达变化，并分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。方法 收集手术切除的新鲜胃癌组织及其癌旁正常胃黏膜组织各60例，采用Western blotting法和免疫组化法检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中的COUP-TFⅡ、NRP2，分析COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系。结果 胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为70.0%、78.3%，正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为30.0%、21.7%。胃癌组织、正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ相对表达量分别为0.84±0.22、0.68±0.34，NRP2相对表达量分别为0.86±0.17、0.58±0.22，胃癌组织中COUP -TFⅡ、NRP2相对表达量均高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)。胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达呈正相关关系(r=0.263，P<0.05)。浸润深度为T3、T4的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于浸润深度T1、T2的胃癌组织(P均<0.05)；中低分化胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于高分化胃癌组织(P均<0.05)；有淋巴结转移的胃癌组织中COUP -TFⅡ、NRP2阳性表达率高于无淋巴结转移的胃癌组织(P均<0.05)。结论 COUP-TFⅡ、NRP2在胃癌组织中高表达，并与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关，二者可能协同参与了胃癌的发生和发展。

胃肿瘤；胃癌；鸡卵清蛋白基因；鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ；神经纤毛蛋白2

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，治疗效果不佳，患者预后差。尽管胃癌的治疗手段不断更新，但中晚期胃癌患者病死率仍较高[1，2]。淋巴结转移导致的胃癌复发及进展期胃癌对放化疗的耐受仍是临床医生面临的难题[3,4]。很多学者认为淋巴管的新生与胃癌转移及预后有密切关系，与淋巴管新生的有关因子有望作为胃癌转移的标志物，同时也是胃癌的治疗靶点。Lin等[5]发现，鸡卵清蛋白上游启动子转录因子 Ⅱ(COUP-TF Ⅱ)可通过上调NRP2表达促进胚胎时期的新生淋巴管形成，在乳腺癌鼠模型中，沉默COUP-TF Ⅱ表达可抑制淋巴管新生，提示该基因在淋巴管新生中起重要作用。既往研究[6]表明NRP2在胃癌组织中表达升高，并能促进癌旁淋巴管的新生，但其机制尚不明确，我们推测COUP-TF Ⅱ可能通过调控NRP2表达促进胃癌发生淋巴结转移。为此，本研究观察了观察胃癌组织中COUP-TF Ⅱ和NRP2的表达变化，并探讨其意义，现报告如下。

1　材料与方法

1.1主要实验材料收集滨州医学院附属医院2015年3～8月手术切除的胃癌组织及其对应癌旁组织各60例份，放入-80 ℃冰箱保存。胃癌患者中，男36例、女24例，年龄35～76岁。所有患者术前未经放、化疗治疗，癌旁组织为正常胃黏膜上皮组织。小鼠抗人COUP-TFⅡ单克隆抗体，兔抗人NRP2多克隆抗体，BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，兔抗人GAPDH多克隆抗体，HRP标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗，免疫组化二抗PV-6001。

1.2COUP-TFⅡ、NRP2检测分别采用Western blotting法和免疫组化法检测胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的COUP-TFⅡ、NRP2。

1.2.1Western blotting法检测COUP-TFⅡ、NRP2 称量胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织各50 mg，提取总蛋白，测定蛋白浓度。各取70 μg总蛋白，加入上样缓冲液，加入8%的SDS-聚丙烯酰氨凝胶小孔进行电泳。电泳条件为80 V恒压。电泳后以300 mA恒流转膜(冰上)，其中内参GAPDH及COUP-TFⅡ转膜时间为90 min，NRP2转膜时间为170 min。转膜完成后用TBST洗5 min×2次。条带于7%脱脂奶粉封闭4 h，加入一抗4 ℃过夜。37 ℃复温0.5 h，回收一抗，TBST洗膜10 min×3次。将膜放入二抗孵育盒摇床上缓慢孵育80 min。TBST洗膜15 min×3次，用ECL发光液曝光。采用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.2.2免疫组化法检测COUP-TFⅡ、NRP2 新鲜标本组织经4%甲醛溶液固定，脱水、浸蜡、包埋，做4 μm厚切片，60 ℃恒温箱中烘烤30 min，进行脱蜡和水化，PBS洗2次、每次5 min。以pH 8.0的EDTA进行抗原修复，降火13 min，冷却至室温。自来水洗5 min，PBS洗2次。3%H2O2浸泡室温15 min。自来水洗5 min，PBS洗2次。滴加一抗，4 ℃过夜，复温20 min。自来水洗10 min，PBS洗2次。加二抗，37 ℃下30 min。自来水洗5 min，PBS洗2次。滴加DAB显色剂显色，自来水终止，流水冲洗5 min。滴加新鲜过滤的苏木素，染色3 min，流水充分冲洗。盐酸酒精中分化5 s，流水冲洗。碳酸锂中返蓝5 s，流水充分冲洗。脱水、透明，封片晾干。以细胞核或细胞质呈棕黄色为目的蛋白表达阳性，根据染色强度和阳性细胞百分比判定结果。染色强度为无着色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分；每张切片在400倍光镜下观察5个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞百分比≤25%计1分、>25%～50%计2分、>50%～75%计3分，>75%计4分；上述两项得分相乘，≥4为蛋白表达阳性。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料比较采用两独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1胃癌组织及正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达比较胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为70.0%、78.3%，正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率分别为30.0%、21.7%,见图1。胃癌组织、正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ相对表达量分别为0.84±0.22、0.68±0.34，NRP2相对表达量分别为0.86±0.17、0.58±0.22，胃癌组织中COUP -TFⅡ、NRP2相对表达量均高于正常胃黏膜组织(P均<0.05)，见图2。胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达呈正相关关系(r=0.263，P<0.05)。

图1　胃癌组织及正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达比较(免疫组化法)

注：T为肿瘤组织，N为正常胃黏膜组织。

图2胃癌组织及正常胃黏膜组织中COUP-TFⅡ、NRP2表达(Western blotting检测)

2.2COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系浸润深度为T3、T4的胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于浸润深度T1、T2的胃癌组织(P均<0.05)；中低分化胃癌组织中COUP-TFⅡ、NRP2阳性表达率高于高分化胃癌组织(P均<0.05)；有淋巴结转移的胃癌组织中COUP -TFⅡ、NRP2阳性表达率高于无淋巴结转移的胃癌组织(P均<0.05)。详见表1。

3　讨论

胃癌的转移包括四种方式，分别是直接蔓延、淋巴结转移、血行转移和腹腔内种植。其中，淋巴结转移是胃癌扩散的主要途径，也是早期转移的主要方式。胃癌的淋巴结转移是一个复杂的过程，多个因子参与其调控。血管内皮生长因子受体(VEGFR)3是首个被发现的淋巴管特异性生长因子受体。胃癌细胞以自分泌或旁分泌形式分泌血管内皮生长因子(VEGF)-C与VEGF-D，这两个因子能与VEGFR3特异性结合，促进淋巴管新生，其中VEGF-C在淋巴管新生和迁移中扮演重要角色[7]。Karpanen等[8]发现NRP2在VEGFC诱导的淋巴管内皮细胞迁移和淋巴管新生中有重要作用，尤其是能够促进肿瘤淋巴管新生。 Favier等[9]发现敲除NRP2的小鼠表现为小淋巴管和毛细淋巴管缺失，充分证实了NRP2在淋巴管生成中的作用。除此之外，NRP2还能增强VEGF-C与VEGFR3的结合能力，而沉默NRP2表达可抑制肿瘤淋巴管新生，并抑制肿瘤淋巴结转移[10]。Lin等[5]证实COUP-TFⅡ参与调节NRP2的表达，因此我们推测COUP-TFⅡ可能为NRP2的上游调节因子，并与胃癌的淋巴结转移密切相关。

表1　COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌临床病理参数的关系

注：与T1、T2浸润深度相比，*P<0.05；与高分化者相比，#P<0.05；与无淋巴结转移者相比，△P<0.05。

COUP-TFⅡ是孤核受体，属于核受体蛋白中的类固醇/甲状腺激素受体超家族。COUP-TFⅡ可调节基因表达、个体发育、细胞分化及内稳态。COUP-TFⅡ还能调节其他核受体的活性，包括雌激素受体、维甲酸受体、甲状腺激素受体、过氧化物酶增殖子激活受体等与细胞增殖和分化有关的受体[11～13]。 Qin等[14]发现，抑制肿瘤微环境中COUP-TFⅡ的表达可抑制肿瘤新生淋巴管的形成。Polvani等[15]发现胰腺癌中COUP-TFⅡ高表达与淋巴结转移、远处侵袭有关，是胰腺癌的不良预后因子。Qin等[16，17]证实COUP-TFⅡ能通过调控VEGF/VEGFR2信号通路影响胰腺癌的血管新生；COUP-TFⅡ还可对抗TGF-β诱导的生长阻滞，促进前列腺癌发生、发展，并与肿瘤复发和预后不良有关。Nagasaki等[18]发现COUP-TFⅡ与乳腺癌临床分期、淋巴结转移、组织学分级和雌激素受体状态有关，是乳腺癌的不良预后因子。研究[19]证实COUP-TFⅡ可通过NF-κB通路来影响乳腺癌的侵袭能力。Navab等[20]通过质粒转染A549细胞，使之高表达COUP-TFⅡ，结果发现该细胞侵袭性明显增强，其机制可能与调控MMP-2表达有关。目前对于COUP-TFⅡ在肿瘤细胞血管生成、淋巴管生成及肿瘤细胞侵袭等方面的作用机制尚未完全明确。我们的前期研究已证明NRP2在胃癌发生、发展及淋巴结转移过程中扮演着重要角色。我们希望通过研究COUP-TFⅡ与NRP2的关系，探索COUP-TFⅡ的相关作用通路。

本研究结果显示，胃癌组织中COUP-TFⅡ及NRP2表达高于正常胃黏膜组织，二者表达呈正相关关系；COUP-TFⅡ、NRP2表达与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴转移有关，这提示COUP-TFⅡ和NRP2在胃癌的发生、发展中可能发挥重要作用。现已证实COUP-TFⅡ可调节NRP2的表达，我们推测NRP2可能为COUP-TFⅡ的下游因子，二者通过共同调节新生淋巴管形成，参与了胃癌的进展。关于COUP-TFⅡ对NRP2的调节是直接调控还是间接调控及其具体机制尚需进一步探索。

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Expression chaneges of COUP-TFⅡ and NRP2 in human gastric carcinoma tissues

WANGKai,LIANHaifeng,NIUQiong,JIAXingfang,LIUChengxia

(AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256600,China)

ObjectiveTo observe the expression changes of chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ (COUP-TFⅡ) and Neuropilin-2 (NRP2) in human gastric carcinoma (GC) tissues and analyze the relationship between their expression and clinicopathological features. Methods Paired tumorous and adjacent non-tumorous human gastric tissues were obtained from 60 patients with GC who underwent surgical resection. We detected the expression of COUP-TF Ⅱand NRP2 by Western blotting and immunohistochemistry. In addition, the relationship between the expression of COUP-TF Ⅱand NRP2 and clinicopathological features was analyzed. ResultsThe positive expression rates of COUP-TFⅡand NRP2 in the GC tissues were 70.0% and 78.3%, in the normal gastric mucosa tissues were 30% and 21.7%, respectively. The relative expression of COUP-TFⅡ in the GC tissues and normal gastric mucosa tissues was 0.84 ± 0.22 and 0.68±0.34, and the relative expression of NRP2 was 0.86±0.17 and 0.58±0.22, respectively. The expression of COUP-TFⅡ and NRP2 in the GC tissues was both higher than that of the normal gastric mucosa tissues (allP<0.05). Moreover, COUP-TFⅡand NRP2 expression was positively correlated with each other (r= 0.263,P<0.05). GC tissues of metastasis at T3, T4stage had higher expression of COUP-TFⅡand NRP2 compared to T1and T2stage (allP<0.05). COUP-TFⅡand NRP2 in moderate and poorly differentiated GC tissues showed higher positive expression rate compared to that in high differentiated GC tissues (allP<0.05). The positive expression rates of COUP-TF II and NRP2 in GC tissues with lymph node metastasis were significantly higher than those in the tissues with no lymph node metastasis (allP<0.05). ConclusionsCOUP-TF Ⅱ and NRP2 is highly expressed in GC tissues and is related to depth of tumor invasion, differentiated grade and lymph node metastasis. As a result, COUP-TF Ⅱand NRP2 may be involved in the tumorigenesis and development synergistically.

Gastric carcinoma; gastric cancer; chicken oralbumin gene; chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ; Nearopilin-2

山东省自然科学基金资助项目(ZR2014HQ072)；山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0490)；滨州市科技发展计划项目(2014ZC0116)。

王凯(1990-)，男，硕士研究生，主要研究方向为胃肠道肿瘤。E-mail： xsdfwkk@163.com

简介：刘成霞(1965-)，女，医学博士，教授，主要研究方向为胃肠道肿瘤。E-mail： phdlcx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.003

R735.2

A

1002-266X(2016)31-0008-04

2016-05-27)