GLUT1在甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同诱导大鼠血脑屏障通透性改变中的作用研究

张冬先，曾柏瑞，何永旺，杨根梦，曾晓锋，李 桢

甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是苯丙胺类兴奋剂，是目前最流行的新型合成毒品之一，具有明显的精神依赖性、高复吸率和神经毒性等特点[1]，长期滥用对神经系统可产生显著的毒性作用，并对滥用者的身心造成严重损害。HIV-Tat蛋白是HIV-1基因编码的内源性蛋白分子，称为反式转录激活因子，能促进HIV基因组转录和复制的激活。大量研究表明，METH与HIV-Tat蛋白能协同诱导神经细胞的毒性作用[2-3]，且METH和HIV-Tat蛋白可对血脑屏障产生严重影响[4-5]。血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是由脑组织内连续微小血管内皮细胞及其之间的紧密连接蛋白、周细胞和星形胶质细胞脚板共同围成的神经胶质膜等构成[6]。葡萄糖转运体-1(glucose transporter 1，GLUT1)是转运葡萄糖通过BBB的重要转运体之一，其以多种结构形式广泛存在于多种细胞。GLUT1的表达情况与大脑中葡萄糖代谢转运密切相关，某些疾病引起的病理状态往往伴随着GLUT1表达及其功能改变[6]，而METH和HIV-Tat蛋白对血脑屏障的影响是否具有协同作用及GLUT1是否参与上述作用的研究报道较少。本研究旨在探讨METH和HIV-Tat蛋白诱导血脑屏障通透性改变过程中是否具有协同作用，且GLUT1是否参与协同作用的调节。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂雄性SD大鼠(体质量230～270 g)由昆明医科大学动物实验中心提供。甲基苯丙胺(纯度>95%)由中国药品生物制品鉴定所提供，用生理盐水溶解成终浓度为2.5 g·L-1备用。HIV-Tat蛋白购自以色列PROSPEC公司，每支10 μg，用生理盐水溶解成终浓度为0.1 mg·L-1备用。伊文思蓝颗粒，每瓶1 g，购自昆明诺贝生物科技有限公司，用生理盐水溶解成终浓度为2 mg·L-1备用。一抗：兔抗-GLUT1购自美国Santa Cruz Biotech公司；二抗：抗-鼠/兔均购自福州迈新生物技术开发有限公司试剂。

1.2 方法

1.2.1 BBB损伤动物模型的建立40只雄性SD大鼠随机分成4组，对照组：每日腹腔注射生理盐水10 mL·kg-1；METH组：每日腹腔注射METH 10 mg·kg-1；HIV-Tat蛋白组：每日尾静脉注射HIV-Tat蛋白400 ng·kg-1；METH+HIV-Tat蛋白组：每日同时注射METH和HIV-Tat蛋白。持续给药7 d。

1.2.2 伊文思蓝Evans blue，EB注射和含量的测定麻醉药物灌注取脑组织之前30 min，尾静脉注射伊文斯蓝(Evans blue，EB)(2 mL·kg-1)溶液，并通过观察大鼠全身皮肤、黏膜、眼部等部位变为蓝绿色后，证实EB溶液成功注入。由于EB的分子量大小与白蛋白相接近，EB进入血浆后可与白蛋白结合，因此EB常被用作BBB破坏的示踪剂。灌注后所取的脑组织用玻璃匀浆器匀浆脑组织并加入3 mL甲酰胺溶液，54 ℃恒温水浴箱中孵育36～48 h，然后离心15～20 min，取上清液测吸光度(λ=620 nm)，并根据标准曲线计算脑组织内EB的含量。

1.2.3 免疫组化将脑组织切片脱蜡水化，用3% H2O2室温灭活内源性过氧化物酶5～10 min，用PBS洗3次，每次5 min。然后用山羊血清封闭30 min。加入兔抗-GLUT1抗体(1∶200)，4 ℃冰箱过夜。第二天切片室温复苏1 h后，加入兔多克隆二抗，37 ℃条件下孵育30 min。然后进行DAB 显色、苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明等步骤，最后用中性树胶封片。

1.2.4 Western Blotting取各组适量脑组织加入蛋白裂解液，在超声破碎仪上破碎脑组织后于4 ℃、14 000 r·min-1离心10 min后取上清。用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。随后取适量蛋白混合5×蛋白上样缓冲液，在沸水浴中煮10 min进行蛋白质变性。进行SDS PAGE电泳，并用半干电转移法将蛋白质转至PVDF膜,再用5%的脱脂奶粉封闭1 h，封口孵育一抗(1∶1 000)于4 ℃冰箱过夜。第二天用TBST洗膜10 min× 3 次，加二抗(1∶5 000 )室温孵育 2 h，用TBST洗膜10 min，3次后ECL显色液激发化学发光，曝光。应用Image J软件分析灰度值。

2 结果

2.1 脑组织EB含量结果正常对照组EB含量为(0.27±0.05) μg·g-1，METH组为(1.16±0.06) μg·g-1，HIV-Tat蛋白组为(0.57±0.05) μg·g-1，METH+HIV-Tat蛋白组为(3.20±0.05) μg·g-1。与对照组相比，METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组EB含量明显升高(P<0.05)。与METH+HIV-Tat蛋白组相比，METH组和HIV-Tat蛋白组EB含量明显减少(P<0.05)。

2.2 GLUT1蛋白免疫组化的结果免疫组化结果显示：GLUT1对照组、METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组均有不同程度的表达。阳性结果表现为血管壁呈棕黄色，GLUT1定位于包膜上。与对照组比较，METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组阳性信号均不同程度降低；与METH组和HIV-Tat蛋白组相比，METH+HIV-Tat蛋白组表达GLUT1水平明显降低。见图1。

A：对照组；B：METH组；C：HIV-Tat蛋白组；D：METH+HIV-Tat蛋白组。各组表达GLUT1水平逐渐降低。图1 GLUT1蛋白免疫组化结果(DAB，×200)

2.2.1 GLUT1阳性细胞的平均光密度值检测各组GLUT1表达的平均光密度值结果如下：对照组平均光密度值为0.925 2±0.119 2、METH组为0.533 1±0.037 9、HIV-Tat蛋白组为0.870 4±0.058 3、METH+HIV-Tat蛋白组为0.336 0±0.042 2。与对照组相比，METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组表达GLUT1阳性细胞的光密度值降低(P<0.05)，与METH+HIV-Tat蛋白组相比，METH组和HIV-Tat蛋白组表达水平有升高(P<0.05)。

2.3 GLUT1蛋白表达的WB结果与对照组相比，METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组GLUT1表达水平明显降低(P<0.05)；与METH+HIV-Tat蛋白组相比，METH组和HIV-Tat蛋白组表达GLUT1水平有所升高(P<0.05)。见图2。

A：GLUT1蛋白的WB表达结果；B：GLUT1/β-actin的表达情况。①与对照组比较，P<0.05；②与METH+HIV-Tat蛋白组相比，P<0.05。图2 GLUT1的表达情况

3 讨论

METH对中枢神经系统具有较强烈的神经毒性。以往研究认为，METH系阳离子脂溶性分子，易通过BBB直接作用于中枢神经系统导致神经毒性，且此过程中METH并不破坏BBB的结构与功能。然而，最近研究表明，METH可以改变BBB内紧密连接蛋白的正常表达水平，降低脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMVEC)跨内皮的阻抗作用，同时增强免疫细胞跨内皮层迁移的运动能力[7]。此外，METH能够通过减少紧密连接蛋白的表达和增加反应活性氧化产物来提高BMVEC的通透性[4，8]。而本研究发现，与对照组相比，METH组大鼠BBB对EB通透性明显升高(P<0.05)，说明METH可改变BBB的通透性。而且，HIV-Tat组大鼠BBB对EB的通透性增加。说明HIV-Tat蛋白可改变BBB的通透性。

METH的滥用增加了HIV感染的风险，并促进HIV感染所致的神经毒性[2]。HIV-Tat蛋白同样可以加重METH的神经毒性作用[9]。本研究发现，与对照组相比，HIV-Tat组大鼠BBB对EB的通透性增加，说明HIV-Tat蛋白可改变BBB的通透性。大量研究表明，METH与HIV-Tat蛋白不仅具有相互作用，两者还具有显著的协同神经毒性作用[2,5,10]。本课题组之前研究已证实METH与 HIV-Tat 蛋白可协同诱导氧化应激反应，可能与其改变血脑屏障通透性作用有关[11]。此外，有研究发现，HIV-Tat蛋白能改变紧密连接蛋白的表达水平以及结构功能[12]。本研究发现，分别与对照组、METH组和HIV-Tat蛋白相比，METH+HIV-Tat蛋白组脑组织中EB含量明显升高(P<0.01)，说明METH与HIV-Tat蛋白可协同诱导BBB通透性的改变。

GLUT1可调控多种组织细胞尤其是脑组织细胞的血糖水平，同时也是决定脑组织葡萄糖转运及其代谢的关键因素。GLUT1在BBB毛细血管内皮细胞中高度特异性表达。在正常情况下脑组织是需要完全依赖葡萄糖作为供能物质，因此葡萄糖转运在脑能量代谢过程中显得尤其重要[6]。METH和HIV-Tat不仅对神经系统具有毒性作用，而且还能协同改变BBB的通透性，此外，本研究发现GLUT1在此过程中发挥着重要作用。本研究免疫组化和WB结果均发现，与对照组相比，METH组，HIV-Tat组和METH+HIV-Tat组表达GLUT1水平不同程度降低，说明GLUT1在METH与HIV-Tat蛋白协同诱导大鼠血脑屏障通透性改变中起重要作用。