表面增强拉曼光谱法测定饮料中4—甲基咪唑和2—甲基咪唑

陈小曼 陈漾 李攻科 胡玉玲 肖小华

摘要：以金纳米粒子为拉曼活性基底，采用便携式拉曼仪进行分析，建立了饮料中4甲基咪唑（4MeI）和2甲基咪唑（2MeI）的表面增强拉曼光谱分析法，并对检测条件进行优化。在最优条件下（Na2SO4溶液为团聚剂，金纳米粒子用量分别为250和200 μL），4MeI和2MeI的线性范围分别是0.05～5.00 mg/L和1.0～20.0 mg/L，检出限分别为1.70 μg/L 和0.21 mg/L；将本法应用于含焦糖色素饮料中4MeI和2MeI 的检测，4MeI含量在0.093～0.110 mg/L之间，2MeI 无检出。回收率分别为80.2%～82.7%和78.1%～93.5%， 相对标准偏差均小于7.1%。本方法简单、快速、准确，为含焦糖色素饮料中4MeI和2MeI的快速检测提供了新方法。

关键词 ：表面增强拉曼光谱法；4甲基咪唑；2甲基咪唑；焦糖色素；饮料

1 引 言

焦糖色素，又称焦糖、焦糖色，是一种在食品中广泛应用的着色剂，常用于酱油、饮料、巧克力等食品的着色。在以氨法或硫酸铵法生产的焦糖色素中，4甲基咪唑（4Methylimidazole， 4MeI）和2甲基咪唑（2Methylimidazole， 2MeI）两种同分异构体以副产物的形式存在，且4MeI具有致癌作用[1～4]。1974年，联合国粮农组织及世界卫生组织（FAO/WHO）食品添加剂委员会规定，由氨法生产的焦糖色素中4MeI含量不得超过200 mg/kg，亚硫酸铵法生产的焦糖色素中4MeI含量不得超过250 mg/kg。目前，4MeI和2MeI的常用检测方法有薄层色谱法[5]、毛细管电泳法[6]、高效液相色谱法[7，8]、气相色谱质谱法[9～12]、液相色谱串联质谱法[13～15]等。但这些方法大多存在分析时间长、仪器昂贵、操作复杂等缺点。因此，建立一种快速、准确测定食品中4MeI和2MeI的新方法具有重要意义。

表面增强拉曼光谱（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）作为一种新型光谱分析技术，具有灵敏度高、分析速度快、检测成本低、检测设备便携、可实现原位实时检测等优点，已逐步发展成为一种具有广泛应用前景的分析检测手段，在食品安全检测领域显示出巨大的应用潜力[16～22]。本研究采用表面增强拉曼光谱法对3种含焦糖色素饮料中的4MeI和2MeI进行检测，为各种含焦糖色素饮料中4MeI和2MeI的快速检测提供了新方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

DeltaNu Inspector便携式拉曼光谱仪（美国DeltaNu公司）；SQP电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；B260型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；SB5200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；GZX9146 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

4甲基咪唑（98%，百灵威试剂公司）；2甲基咪唑（98%，阿拉丁试剂公司）；KAuCl4·2H2O（含金48%～50%，阿拉丁试剂公司）；柠檬酸三钠（分析纯，沈阳市试剂三厂）；三氯甲烷、无水乙醇、KNO3、Na2SO4等试剂（分析纯，广州化学试剂厂）；实验用水为超纯水；3种饮料（包括风味饮料，果蔬饮料和碳酸饮料）购于广州市海珠区某超市。

2.2 金纳米粒子（AuNPs）的制备

参考文献＼[23＼]的方法并略有改进，将200 mL超纯水与1.00 mL 2%（w/w）HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶后，在140℃油浴锅中加热搅拌至沸，沸腾5 min后，加入1.48 mL 1%（w/w）柠檬酸钠溶液，加热反应40 min后移开热源，冷却密封保存于暗处，制成的金纳米粒子呈紫红色。

2.3 标准溶液的配制

准确称取4MeI和2MeI标准品各10 mg（精确至0.0001 g）， 以超纯水溶解并定容至10 mL，配制成1000 mg/L标准储备液；标准储备液用超纯水稀释，配成50.0 mg/L标准中间液。以超纯水将标准中间液配制成各所需浓度的标准工作液，储备液于4 ℃贮存。

2.4 样品处理

量取1 mL样品于250 mL分液漏斗中，加100 g/L碳酸钠水溶液5 mL，加三氯甲烷无水乙醇萃取液（8∶2， V/V）20 mL，劇烈振摇5 min。静置分层后，将有机相移入另一个分液漏斗中，水相再按同样方法萃取一次，合并有机相；用100 g/L Na2CO3洗涤提取液3次，每次10 mL。将有机相通过无水Na2CO3滤入旋转蒸发瓶中，50 ℃浓缩至近干，以水溶解残渣并定容至1 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后用于SERS分析[24]。

2.5 分析过程

移取适量金纳米粒子、待测分析液和团聚剂于拉曼管中，摇匀后进行SERS检测。

拉曼仪器参数：激光功率为60 mW，激光时间为5 s，激光次数为1次，每次采谱扣除暗电流1 s，测试模式为Software，所获得的拉曼谱图不扣除荧光。

3 结果与讨论

3.1 特征峰归属

3.2.2 团聚剂用量的优化

适量Na2SO4能使金纳米粒子发生一定团聚，从而增强SERS信号。当Na2SO4过量时，金纳米粒子会发生过度团聚，而大大影响SERS效果。本实验考察了Na2SO4用量对4MeI和2MeI分析时SERS强度的影响。结果表明，4MeI检测的最优条件是团聚剂Na2SO4浓度为1.00 mol/L， 体积为30 μL；2MeI的最优条件是Na2SO4的浓度为0.50 mol/L，体积为100 μL。

3.3.4 试剂加入顺序的优化

分析物与Na2SO4的加入顺序对两种物质的SERS响应影响较大。若先加入Na2SO4， 使金纳米粒子发生团聚后，再加入分析物，其SERS效果较差；而先将金纳米粒子和分析物混合之后，再加入Na2SO4，其SERS效果较好。对于4MeI和2MeI，后者的SERS强度（以峰面积计算）分别是前者的7.2倍和9.5倍。因此，试剂的加入顺序为金纳米粒子、分析物、Na2SO4。

3.3.5 分析液酸碱度的优化

4MeI和2MeI特征峰峰强度受分析液酸碱度的影响均较大。分别以6 mol/L HCl和10 mol/L NaOH溶液将分析液调节为酸性和碱性后，进行SERS分析，并与不进行酸碱度调节的分析液进行对比。结果表明，对于4MeI和2MeI，当分析液使用水溶液配制，不进行酸碱度调节时，pH≈7，SERS效果最佳。所以，选择使用水溶液配制分析液，无需另加入酸或碱调节溶液酸碱度。

3.3 分析方法建立

3.4 实际样品检测

利用上述方法对从广州某超市购买的3种含有焦糖色素的饮料进行SERS定量分析检测，并进行加标回收实验， 验证方法的准确性，结果见表2。图3是3种饮料中4MeI和2MeI分析的SERS谱图。3种市售饮料中均检出4MeI，且含量较低，而2MeI尚无检出。本方法测定的4MeI和2MeI回收率分别为80.2%～82.7%和78.1%～93.5%，相对标准偏差分别为5.9%～7.1%和1.5%～3.6%。

4 结 论

以柠檬酸钠还原法制备的金纳米粒子为SERS基底，粒子无需浓缩，很好地克服了浓缩后粒子易团聚而不稳定， 甚至失去增强效果的缺点。通过优化团聚剂（种类、浓度和体积）、金纳米粒子的用量、试剂加入顺序、分析液酸碱度等条件，建立了4MeI和2MeI的SERS分析方法，并应用于市售含有焦糖色素的饮料中4MeI和2MeI的检测。3种饮料均检出4MeI，而未检出2MeI。本研究为饮料中4MeI和2MeI的检测提供了新方法。

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Abstract A method was developed for the determination of 4methylimidazole （4MeI） and 2methylimidazole （2MeI） in drinks by surfaceenhanced Raman spectroscopy with Au nanoparticle as substrate， and the detection conditions were optimized. Under the optimum conditions， by using sodium sulfate aqueous solution as agglomeration solution， and 250 or 200 μL of Au nanoparticle as substrate， the linear ranges of 4MeI and 2MeI were 0.05-5.00 mg/L and 1.0-20.0 mg/L with detection limits of 1.70 μg/L and 0.210 mg/L， respectively. While applied in the determination of 4MeI and 2MeI in drink with lift caramel， the concentration of 4MeI was determined to be 0.093-0.110 mg/L and 2MeI was not detected. The average recoveries of 4MeI and 2MeI were in the range of 80.2%-82.7% and 78.1%-93.5% with relative standard deviations <7.1%. Above all， this method was turned out to be simple， rapid and sensitive， providing a new method for rapid analysis of 4MeI and 2MeI in drink with lift caramel.

Keywords Surfacedenhanced Raman spectroscopy； 4Methylimidazole； 2Methylimidazole； Lift caramel； Drinks