金匮肾气丸对创伤后应激障碍综合征孕鼠子代行为遗传及多巴胺的影响

彭思涵，刘祥敏，蒋晓静，曹 俊，龙芋君，张先庚



·论著·

·中医·中西医结合研究 ·

金匮肾气丸对创伤后应激障碍综合征孕鼠子代行为遗传及多巴胺的影响

彭思涵，刘祥敏，蒋晓静，曹 俊，龙芋君，张先庚

背景近年来，创伤后应激障碍综合征(PTSD)的发生率呈上升趋势。采用西医对PTSD进行治疗存在药物不良反应、疗效及疗程不确定性等诸多问题，对孕妇危害更大。目的观察金匮肾气丸对PTSD孕鼠子代生长发育、行为能力及血清多巴胺(DA)水平的影响。方法2014年7月—2015年3月，采用随机数字表法将初次受孕的36只SD孕鼠分为空白组、PTSD组、中药组，每组各12只。妊娠中期，PTSD组和中药组孕鼠采用单程长时应激法进行创伤应激造模，造模后中药组给予金匮肾气丸饲料至分娩。子鼠出生后第5、15、25天测量身长、尾长以反映生长发育状况；第15天进行亮盒排便测试，第26天进行糖水消耗试验，以观察其行为能力；第30天抽取股动脉血，采用酶联免疫吸附试验法检测血清DA水平。结果不同处理方法、时间在子鼠身长和尾长上主效应显著(P<0.05)，不同处理方法和时间在子鼠身长和尾长上存在交互作用(P<0.05)。PTSD组亮盒排便测试阳性率高于空白组和中药组，糖水偏嗜度低于空白组和中药组(P<0.05)，中药组和空白组间差异无统计学意义(P>0.05)。PTSD组血清DA水平低于空白组和中药组(P<0.05)，中药组和空白组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论金匮肾气丸可纠正孕鼠PTSD导致的子代生长发育迟缓、行为异常、血清DA紊乱，其作用机制可能与先天补肾温阳、髓海充盈、脑神充养有关。

肾气丸；应激障碍,创伤后；动物行为学；多巴胺

彭思涵，刘祥敏，蒋晓静，等.金匮肾气丸对创伤后应激障碍综合征孕鼠子代行为遗传及多巴胺的影响[J].中国全科医学，2016，19(27)：3322-3325.[www.chinagp.net] PENG S H,LIU X M,JIANG X J,et al.Impact of Jinkui Shenqi pills on behavioral genetics and dopamine of offspring from pregnant rats with post-traumatic stress disorder syndrome[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3322-3325.

创伤后应激障碍综合征(posttraumatic stress disorder，PTSD)的临床核心症状是创伤性记忆的不断闯入，导致患者出现恐惧、抑郁、逃避行为和过度唤醒的生理反应[1]。多数文献报道，PTSD的基本病变为中枢神经系统紊乱[2-3]，主要涉及海马、杏仁核与内侧前额叶皮层神经环路在PTSD恐惧记忆发生和消退中的重要作用[4]。祖国医学认为，PTSD的发病机制为惊恐伤肾、脑神失调、肝失疏泄[5]。笔者导师前期研究表明，补肾中药金匮肾气丸可纠正孕鼠恐惧致子代肾虚的生理和行为紊乱[6-7]，故本实验采用国际PTSD科学会议确定的大鼠PTSD造模方式——单程长时应激(single prolonged stress paradigm,SPS)法[8]对孕鼠进行造模，伤其肾气，予以金匮肾气丸温补肾阳，通过对子代生长发育、行为能力及血清多巴胺(dopamine，DA)水平进行观测，以探究金匮肾气丸对PTSD孕鼠的调护效果。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物成都达硕生物科技有限公司提供SPF级SD大鼠雌性36只、雄性18只〔生产合格证号：SCXK(川)2013-24〕。90日龄左右，均无生育史，体质量270～310 g。

1.1.2实验药物金匮肾气丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司生产(批号Z11020147)，成分：地黄、山药、山茱萸(酒炙)、茯苓、牡丹皮、泽泻、桂枝、附子(炙)、牛膝(去头)、车前子(盐炙)。

1.2实验方法

1.2.1实验分组2014年7月—2015年3月，将大鼠按雌∶雄=2∶1 的比例随机合笼交配，以发现阴栓视为妊娠。将初次交配成功的36只孕鼠采用随机数字表法分为空白组、PTSD组、中药组，每组12只，并分别编号。体质量：空白组(294.6±15.1)g，PTSD组(295.8±12.6)g，中药组(297.0±11.5)g，各组体质量间差异无统计学意义(F=0.100，P>0.05)。

1.2.2造模妊娠中期(妊娠第7～13天)：PTSD组和中药组采用SPS法进行创伤应激造模，即大鼠禁锢2 h后，立即强迫游泳20 min(水深40 cm，水温25 ℃)。该模型与PTSD患者在行为、病理及生理学等方面相似，具良好的表面效度、结构效度及可预测效度[9]。

1.2.3干预措施造模后至分娩：中药组予以金匮肾气丸饲料，按成人每公斤体质量用量的10倍换算(体质量 50～60 kg 的成人10 g/d，折算出体质量 250～300 g 的大鼠为0.5～0.6 g/d)[10]，将金匮肾气丸研碎后按上述比例加入常规饲料。空白组和PTSD组常规饲料喂养。3组孕鼠在预产期前2 d(妊娠第17天)进行分笼单独饲养，以便观测和记录。

本文创新点：

(1)思路创新：关于创伤后应激障碍综合征(PTSD)亲子遗传的研究大多为回顾性研究，本实验开创性地将PTSD造模方式应用于孕鼠实验，并且从中医胎教与胎损角度进行观察和研究。

(2)方法创新：本实验给予PTSD孕鼠补肾中药，阐释“恐伤肾”、“肾阳虚”是PTSD“胎损”基本病机。为中医治疗PTSD提供临床思路和方法。

(3)内容创新：本实验融合了行为学、神经生物学、遗传学、创伤学、神经精神病学等多学科，更深入细致地全面阐明了孕鼠恐惧应激对子代的危害以及补肾中药干预效果。

1.2.4观察指标及测定分娩后，空白组子鼠162只，PTSD组子鼠156只，中药组子鼠158只。每次检测某指标时，每组均采用随机数字表法单独选取子鼠进行检测。(1)身长和尾长测定：子鼠出生第5天，每组选取30只测其身长、尾长，于出生第15、25天重复测量。(2)亮盒排便测试[5]：子鼠出生第15天，每组选取子鼠(空白组14只，PTSD组24只，中药组22只)进行亮盒排便测试。(3)糖水消耗试验[11]：子鼠出生第26天，每组选取18只进行糖水消耗试验，检测糖水偏嗜度。(4)血清DA水平检测：子鼠出生第30天，每组选取10只，抽取股动脉血，采用酶联免疫吸附试验法检测血清DA水平，按说明书操作，采用DENLEY DRAGON Wellscan MK 3型酶标仪检测吸光度，吸光度的检测波长为450 nm。

2　结果

2.13组子鼠不同时间点身长、尾长比较对子鼠第5、15、25天身长、尾长测量数据中Mauchly球形度检验W值分别为0.891、0.879，P<0.05，不符合F-H条件，选取多元方差分析并参考Greenhouse-Geisser校正[12]，结果显示：不同处理方法、时间在子鼠身长和尾长上主效应显著(P<0.05),不同处理方法与时间在子鼠身长和尾长上存在交互作用(P<0.05,见表1)。

表1　3组子鼠不同时间点身长和尾长比较±s，cm)

注：PTSD=创伤后应激障碍综合征；与空白组比较，aP<0.05；与PTSD组比较，bP<0.05

2.23组子鼠行为能力比较

2.2.1亮盒排便测试结果3组子鼠亮盒排便测试结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)；PTSD组亮盒排便测试阳性率高于空白组和中药组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药组和空白组间差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.2.2糖水消耗试验结果3组子鼠糖水偏嗜度比较，差异有统计学意义(P<0.05)；PTSD组糖水偏嗜度低于空白组和中药组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药组和空白组间差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表2　3组子鼠亮盒排便测试结果比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与PTSD组比较，bP<0.05

表3　3组子鼠糖水偏嗜度比较±s，%)

注：与空白组比较，aP<0.05；与PTSD组比较，bP<0.05

2.3血清DA水平比较3组子鼠血清DA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；PTSD组血清DA水平低于空白组和中药组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药组和空白组间差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

3　讨论

3.1孕鼠恐惧应激对子代生长发育的影响中医认为，先天肾精(包括父母天癸) 是胚胎发育的遗传物质基础，可以促进机体生长发育。孕鼠肾气亏虚，子代肌骨筋肉生长所需的营养物质供应不足，加上后天脾失健运，水谷精微不能濡养五脏，故本实验PTSD组子鼠身长、尾长等生长发育明显差于空白组。

表4　3组子鼠血清DA水平比较

注：DA=多巴胺；与空白组比较，aP<0.05；与PTSD组比较，bP<0.05

3.2孕鼠恐惧应激对子代行为能力的影响肾与膀胱相表里且二者相通，膀胱的气化赖肾气之蒸腾，所以肾的病变可导致膀胱气化失司，引起尿量、排尿次数、排尿时间的改变。大便之秘或泄与肾也密切相关：肾为水脏，火衰则水盛，反侮脾土，土不能制水，而为大便泄泻。另外，脾运化水液，肾阳不足，火不暖土，脾阳不振，脾气下陷，运化失职，为便为溺。

亮盒排便测试用二便粒次衡量动物情绪遗传力大小，可作为中医“恐伤肾”、“恐则气下”的客观指标之一[10,13]。本实验中，PTSD组子鼠亮盒排便测试阳性率高于空白组，说明子代肾封藏失职，二阴失约。糖水消耗试验常被用来测定子鼠抑郁程度以及快感降低程度[11]，本实验PTSD组子鼠出生第26天糖水偏嗜度低于空白组，表现出对糖水刺激的低敏性，说明该组子鼠奖赏系统快感缺乏。国内邢志强[14]对孕鼠进行21 d慢性不可预知应激后，发现孕鼠糖水偏嗜度下降，本研究结果与之一致。本实验中孕鼠PTSD造模后子代行为表现变差，说明子鼠高级中枢受到影响。

3.3孕鼠恐惧应激对子代血清DA水平的影响DA与记忆密切相关，通过相应的膜受体参与锥体外系的运动、认知、精神情绪、神经内分泌等生理、病理的调控过程，影响机体一般行为和精神活动[15]。RASHEED等[16]在对大鼠进行不可预见的急性或慢性应激后，大鼠处于抑郁状态，并且海马、杏仁核等脑区的DA水平降低。动物和人类研究均证实，PTSD的发生与杏仁核-内侧前额叶皮质-海马通路DA能系统有关[17-18]，包括相关受体[19]、转运体[20]和DA β-羟化酶[21]等。ENMAN等[22]采用SPS法对大鼠进行PTSD造模实验中指出，DA系统病理改变和奖赏回路功能低下可导致创伤后应激障碍相关症状，并可以预测药物滥用或者抑郁等精神障碍的出现。本实验中，PTSD组子鼠血清DA水平低于空白组，DA水平的降低可引发抑郁、恐惧等情志障碍。

有研究报道，相比非PTSD患者的后代，PTSD患者后代更易患PTSD[23]，单卵双生子经历创伤事件后PTSD发生率比异卵双生者高[24]，提示遗传因素在PTSD疾病发生发展过程中有重要作用。金匮肾气丸为治疗肾虚证的经典方剂，其组方及药物配伍为六味地黄丸(地黄、山药、山萸肉、泽泻、茯苓、牡丹皮)滋补肝肾之阴，(附子、桂枝)壮肾中之阳，二者相互为用，以阴生阳长，阳得阴助而生化无穷，从而和调气血，通利经脉，助脾之运化与胃之受纳腐熟，聚血以养胎。本实验中，中药组予以金匮肾气丸饲料，改善孕鼠创伤应激致子代生长发育迟缓，降低子鼠亮盒排便测试阳性率并提高其糖水偏嗜度，纠正血清DA异常，表明金匮肾气丸调护PTSD孕鼠子代肾阳虚具有较好效果，亦为临床治疗PTSD提供新思路和新方法。

作者贡献：彭思涵、刘祥敏、张先庚进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；蒋晓静、曹俊、龙芋君进行实验实施、评估、资料收集；张先庚进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：赵跃翠)

Impact of Jinkui Shenqi Pills on Behavioral Genetics and Dopamine of Offspring from Pregnant Rats with Post-traumatic Stress Disorder Syndrome

PENGSi-han,LIUXiang-min,JIANGXiao-jing,CAOJun,LONGYu-jun，ZHANGXian-geng.

ChengduUniversityofTCM，Chengdu610075，ChinaCorrespondingauthor:ZHANGXian-geng,SichuanNursingVocationalCollege,Chengdu610100，China;E-mail：xiangengzhang666@sina.com

BackgroundThe incidence rate of post-traumatic stress disorder (PTSD) syndrome has increased in recent years.Western medicine treatment of PTSD leads to adverse drug reactions,uncertainties of curative effect and treatment,and other problems that are especially harmful for pregnant women.ObjectiveTo observed the effect of Jinkui Shenqi pills on growth and development,behavior capacity,and serum dopamine (DA) level of offspring from pregnant rats with post-traumatic stress disorder (PTSD).MethodsFrom July 2014 to March 2015,36 pregnant rats were divided into:control group (CG),PTSD group (PG),and herbal group(HG) by random number table method.There were 12 rats in each group.The pregnant metaphase rats in PG and HG were transformed to PTSD models via single-prolonged stress (SPS),which has been extensively applied in PTSD research.After the models were established,the rats in HG were given Jinkui Shenqi pills.The body and tail lengths of rats were measured 5,15,and 25 days after birth to observe growth and development status.Behavioral ability was evaluated by different behavioral tests at different times,including light box defecation test (15 days after birth) and saccharose consumption test (26 days after birth).Femoral arterial blood of the offspring was sampled on the 30 days after birth,and serum dopamine level was detected by enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA).ResultsThere was significant effect on body length and tail length among different treatment ways and time (P<0.05),there was interaction on body length and tail length between treatment ways and time (P<0.05). The positive rate in light box defecation test of PG was higher than that of CG and HG (P<0.05),whereas the sucrose preference rate in PG was significantly lower than that of CG and HG(P<0.05).However,no statistically significant differences were observed between CG and HG (P>0.05).The serum level of dopamine in PG was lower than that in CG and HG (P<0.05),but no statistically significant differences were observed between CG and HG (P>0.05).ConclusionJinkui Shenqi pills could alleviate growth retardation,abnormal behavior,and serum dopamine level disturbance of the offspring caused by PTSD-induced fetal injury.The regulation of offspring neurobiology disorder can be achieved by supplying kidney essence,thereby warming and invigorating the kidney yang,filling the marrow,and nourishing the cerebral spirit.

Shenqi pill;Stress disorders,post-traumatic;Ethology；Dopamine

国家自然科学基金资助项目(81373710)；四川省教育项目基金(13ZA0273)

610075 四川省成都市，成都中医药大学(彭思涵，刘祥敏，蒋晓静，曹俊，龙芋君)；四川护理职业学院(张先庚)

张先庚，610100 四川省成都市，四川护理职业学院；E-mail：xiangengzhang666@sina.com

R 749.72

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.013

2016-02-10；

2016-07-15)