FTY720调控DC表面趋化因子及其受体表达的机制研究

熊 苗，包春玲，周芳芳

(上海健康医学院附属第六人民医院东院 妇产科，上海200123)

胚胎作为母体半同种异体组织抗原未被母体排斥而能成功存活，与母体妊娠免疫耐受有关。近年来研究显示，妊娠免疫耐受紊乱在原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)中发挥至关重要作用[1]。FTY720是一种从冬虫夏草中提取的多球壳菌素经化学修饰后的合成物，具有独特药理活性，能作用于淋巴细胞发挥免疫抑制作用，并与其他免疫抑制药物具有协同作用，在自身免疫性疾病动物模型及器官移植中具有良好应用前景[2，3]。FTY720作为1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)受体激动剂，通过拮抗S1P与受体结合，影响T细胞分化及功能，参与介导免疫耐受。鉴于FTY720的免疫抑制作用，本课题组前期采用FTY720干预自然流产孕鼠后能显著降低孕鼠胚胎丢失率，但其具体机制尚不明确[4]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是功能最强的抗原提呈细胞，在诱导机体免疫耐受及维持免疫应答等过程中发挥关键作用。研究显示，FTY720对DC细胞的毒性和吞噬性无明显影响，但对其表面趋化因子及其受体分泌具有下调作用[5]。本研究以自然流产孕鼠为研究对象，通过构建S1P-siRNA及过表达S1P慢病毒载体转染DC细胞，探讨过继转移两种慢病毒载体前后FTY720对DC的影响，旨在为临床治疗URSA提供新的治疗靶点和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性CBA/J小鼠、雄性DBA/2小鼠和雄性Balb/c小鼠，均为SPF级，6-8周龄，原种购自日本国立遗传研究所，后由中国科学院上海实验动物中心遗传室保种留存，经检验遗传质量检测符合本品系国际标准。于本实验室无菌条件下适应性饲养2周。本研究经上海市第六人民医院伦理委员会审核批准，给予动物人道主义关怀，实验过程符合3R原则。

1.2 主要试剂和仪器

FTY 720(上海嘉远生物科技有限公司)；S1P过表达和S1P-siRNA慢病毒载体(上海卫蓝海洋材料科技有限公司)；趋化因子受体CCR7、CCL19多抗，FITC标记的兔抗小鼠CD80、CD40、CD86、MHCII单抗以及IgG同型对照(美国Biolegend公司)；rmGM-CSF、mIL-4(美国Gibco公司)；流式细胞仪及分CD1a磁珠抗体(美国BD公司)。

1.3 方法

1.3.1转染DC

DBA/2雄鼠骨髓来源DC分离、培养及鉴定，具体方法同前期研究工作[6-8]；转染S1P过表达慢病毒载体、S1P-siRNA慢病毒载体的DC结果及鉴定见前期研究[4]。

1.3.2动物建模及分组

雌性CBA/J小鼠和雄性Balb/c小鼠按2∶1比例合笼，建立正常妊娠孕鼠模型(CBA/J×Balb/c)；雌性CBA/J小鼠和雄性DBA/2小鼠按2∶1比例合笼，建立自然流产孕鼠模型(CBA/J×DBA/2)，合笼后每日8:00和14:00检查阴道栓，以出现阴道栓为孕1 d。

孕鼠分组：①正常妊娠模型组(CBA/J×Balb/c)，Balb/c雌鼠于合笼前2 d腹腔注射1 mL FTY720，1次/d，连续2 d；②自然流产模型组(CBA/J×DBA/2)，不干预；③FTY720组(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合笼前2 d腹腔注射1 mL FTY720，1次/d，连续2 d；④FTY720+S1P-siRNA-DC组(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合笼前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同时尾静脉注射1 ml S1P-siRNA-DC(含2.5×106个细胞)，1次/d，连续2 d；⑤FTY720+过表达S1P-DC组(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合笼前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同时尾静脉注射1 ml过表达S1P-DC(含2.5×106个细胞)，1次/d，连续2 d；⑥FTY720+空载组(CBA/J×DBA/2)，CBA/J雌鼠于合笼前2 d腹腔注射1 ml FTY720，同时尾静脉注射1 ml空载慢病毒载体-DC(含2.5×106个细胞)，1次/d，连续2 d。

1.3.3计算孕鼠胚胎丢失率[9]

于孕12-14 d，对孕鼠胚胎丢失率进行统计。丢失胚胎可见体积缩小、胎盘出血甚至坏死。胚胎体积缩小以胚胎体积<同龄胎盘平均体积减去2个标准差为统计标准，胚胎丢失率=丢失胚胎数/丢失胚胎数与存活胚胎数之和×100%。

1.3.4检测DC数量及其表面CCR7/CCL19表达

于孕12-14 d采集孕鼠血样(眼内眦静脉采血)，颈椎脱臼法处死孕鼠，留取蜕膜，流式细胞仪检测外周血和蜕膜组织中DC数量及其表面CCR7表达情况，具体方法参照前期研究[10,11]；取胎盘蜕膜组织，制备石蜡切片，按照CCL19抗体免疫组化试剂盒说明书进行染色，检测趋化因子CCL19表达情况，染色强度分为4个等级：±，+，++，+++，等级越高代表阳性表达越多。

1.3.5流式细胞术检测DC凋亡及分化情况

获取各组孕鼠骨髓来源DC[10,11]，重悬调整至1×106个/mL，分别加入100 μg/L、50 μg/L的重组GM-CSF和IL-4，于培养3 d、5 d时半量换液，加入细胞因子，于第5天收集部分细胞，离心后，使用流式细胞仪检测细胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CD40表达，剩余细胞加入100 μg/L的LPS，48 h后检测细胞CD80、CD86、MHC-Ⅱ、CD40表达。

1.3.6Transwell小室实验检测DC趋化能力

趋化实验：将分离的DC液进行重悬，用不含BSA的DMEM培养基对细胞进行饥饿处理过夜，重悬细胞调整浓度为1×105～1×106个/mL。将600 μl梯度浓度CCL19溶液加入24孔板，24孔板中放入Transwell小室，小室上室加入200 μl DC悬液(过继转移S1P-siRNA-DC和过表达S1P-DC前后与不同浓度的FTY720共培养)，5% CO2培养箱37℃培养20 h，取出小室，多聚甲醛固定(4%)20 min，结晶紫(0.1%)染色30 min，显微镜下观察并对细胞计数，随机选取5个视野，以平均值表示。

中和实验：在上述含CCL19的溶液中，加入1 μg/mL CCL19抗体，于37 ℃条件下孵育1 h，其余步骤同趋化实验。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 过继转移过表达S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720对孕鼠胚胎丢失率的影响

FTY720干预后自然流产模型孕鼠胚胎丢失率明显降低(P<0.05)；过继转移S1P-siRNA-DC后，FTY720对自然流产模型孕鼠胚胎丢失率无明显影响(P>0.05)；过继转移S1P-DC后，FTY720能明显降低自然流产模型孕鼠胚胎丢失率(P<0.05)，见表1。

表1 各组孕鼠胚胎丢失率

2.2 过继转移过表达S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720对孕鼠外周血DC数量及CCR7表达的影响

FTY720干预后自然流产孕鼠外周血DC数量及CCR7表达率较干预前明显降低(P<0.05)；过继转移S1P-siRNA-DC后，孕鼠外周血DC数量及CCR7表达率无明显变化(P>0.05)，过继转移过表达S1P-DC后，孕鼠外周血DC数量及CCR7表达率进一步降低(P<0.05)，见表2。

表2 孕鼠外周血DC数量及表面CCR7的表达

2.3 过继转移过表达S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720对孕鼠蜕膜组织中DC数量及其CCR7表达的影响

FTY720干预后自然流产孕鼠蜕膜组织中DC数量及CCR7表达率较干预前明显降低(P<0.05)；过继转移S1P-siRNA-DC后，孕鼠蜕膜组织中DC数量及CCR7表达率无明显变化(P>0.05)，而过继转移S1P-DC后，孕鼠蜕膜组织中DC数量及CCR7表达率进一步降低(P<0.05)，见表3。

表3 孕鼠蜕膜组织DC数量及CCR7的表达

2.4 过继转移过表达S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720对孕鼠蜕膜组织中CCL19表达的影响

FTY720干预后自然流产孕鼠蜕膜组织中CCL19表达较干预前明显降低(P<0.05)；在FTY720干预基础上过继转移S1P-siRNA-DC后，孕鼠蜕膜组织中CCL19表达无明显变化(P>0.05)，而过继转移过表达S1P-DC后，孕鼠蜕膜组织中CCL19表达进一步降低(P<0.05)，见表4。

表4 孕鼠蜕膜组织中CCL19的表达

2.5 过继转移过表达S1P-DC和S1P-siRNA-DC前后FTY720对DC分化及凋亡的影响

未干预前DC凋亡率为(8.21±0.25)%，过继转移过表达S1P-DC和S1P-siRNA-DC后，DC凋亡率为(8.33±0.33)%、(8.29±0.31)%，提示过继转移两种慢病毒前后DC凋亡率无明显差异(P>0.05)。各组孕鼠DC表面CD80、CD86、MHCII、CD40表达百分率无明显差异(P>0.05)。

2.6 趋化实验和中和实验结果

Transwell小室DC数量随着FTY720浓度增加而减少(P<0.05)。过继转移S1P-siRNA-DC后，DC细胞数量明显增加(P<0.05)；过继转移过表达S1P-DC后，DC数量明显减少(P<0.05)。而加入CCL19抗体后，过继转移S1P-siRNA-DC或过表达S1P-DC前后DC数量无明显变化(P>0.05)。

3 讨论

母胎免疫耐受失衡是URSA的主要发病机理，探讨诱导免疫耐受的方法可为URSA患者提供新的治疗途径。DC是母胎界面重要免疫活性细胞，其质和量的异常在URSA中发挥重要作用，URSA患者局部组织中免疫活性细胞自外周被募集而来，而非由前体细胞在蜕膜中我更新形成，其中趋化因子及其受体在招募过程中发挥重要作用[12]。

S1P与受体结合，可介导淋巴细胞再分布，FTY720作为S1P受体激动剂，可拮抗S1P与受体结合，与淋巴细胞迁移、凋亡以及归巢密切相关[13]。本研究以FTY720干预孕鼠，同时构建S1P过表达和S1P-siRNA慢病毒载体转染DC，观察过继转移前后，FTY720对自然流产模型孕鼠胚胎丢失率的影响，结果显示，FTY720能明显降低自然流产模型孕鼠胚胎丢失率，过继转移S1P-siRNA-DC后，FTY720对自然流产模型孕鼠胚胎丢失率无明显影响，过继转移S1P-DC后，FTY720能明显降低自然流产模型孕鼠胚胎丢失率，与前期研究结果一致[14]，提示FTY720可能通过阻断S1P信号通路诱导免疫耐受。

为进一步研究FTY720如何通过S1P信号通路影响相关免疫细胞发挥调节作用，本研究通过检测孕鼠外周血和蜕膜局部组织中DC数量、DC表面CCR7和CCL19表达及DC凋亡分化情况，结果显示，FTY720能明显减少DC数量，减少DC表面CCR7和CCL19表达，过继转移S1P-siRNA-DC后，DC数量明显增多，而过继转移过表达S1P-DC后，DC数量明显减少，同时CCR7和CCL19表达降低，而两者对DC细胞凋亡和分化无影响，提示FTY720可能通过抑制DC表面趋化因子及其受体表达，致使趋化至母胎界面的DC数量减少，从而诱导免疫耐受，经进一步趋化实验验证，FTY720与DC共培养后DC数量减少，过继转移S1P-siRNA-DC后，DC数量明显增加，过继转移过表达S1P-DC后，DC数量明显减少，而加入CCL19抗体后，过继转移S1P-siRNA-DC和过表达S1P-DC前后DC数量无明显变化，提示FTY720诱导免疫耐受，发挥降低自然流产孕鼠胚胎丢失率作用，可能是通过阻断S1P信号通路干扰孕鼠体内DC表面趋化因子及其受体表达，减少母胎界面DC细胞数量发挥免疫抑制作用。