贵阳市5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌种类及携带真菌病毒调查*

江银辉， 张　彪， 吴昌学， 袁　清， 官志忠， 张婷婷**

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵州医科大学 生物工程学院， 贵州 贵阳　550004)



贵阳市5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌种类及携带真菌病毒调查*

江银辉1， 张彪1， 吴昌学1， 袁清2， 官志忠1， 张婷婷2**

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学 生物工程学院， 贵州 贵阳550004)

目的： 分析贵阳市5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌种类及携带真菌病毒的情况。方法： 采用含50 mg/L头孢霉素的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板敞口置于病房 24 h后收集平板培养，检测5所医院呼吸科病房空气中曲霉菌株；采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取真菌病毒DNA、纤维素吸附的方法提取菌病毒双链RNA(dsRNA)，琼脂糖凝胶电泳检测真菌病毒。结果： 共收集到曲霉菌597株，其中黄曲霉菌株467株，烟曲霉菌株90株，黑曲霉菌株40株；CTAB法未检测到DNA病毒，纤维素吸附法检测到dsRNA病毒，90株烟曲霉菌株中有11株含有dsRNA病毒，病毒电泳条带类型有2种；467个黄曲霉菌株中有24株含有dsRNA病毒，病毒电泳的条带类型有3种；40个黑曲霉菌株有9株含有dsRNA病毒，病毒电泳条带类型只有1种。结论： 烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌株中携带有较多dsRNA病毒。

曲霉菌； 抗真菌药； 真菌病毒； RNA病毒； 琼脂糖凝胶电泳； 贵阳

[Abstract]Objective: To analyze the variety of aspergillus species in respiratory wards of 5 hospitals, and the mycoviruses in the collected aspergillus isolates. Methods: Potato dextrose agar (PDA) culture media plates containing 50 mg/L cephalosporin were placed in respiratory wards of 5 hospitals for 24 h, then the plates were collected for cultivating aspergillus isolates. Detection The aspergillus strains in air in respiratory wards of 5 hospitals was detected. DNA was extracted from fungal mycelia with the use of CTAB method, dsRNA (double strand RNA) was extracted from fungal mycelia using CF-11 cellulose column chromatography and agarose gel electrophoresis was adopted to detect mycoviruses. Result: In this research, 597 aspergillus isolates were collected, of which 467 wereA.flavusisolates, 90A.fumigatusisolates and 40A.nigerisolates. No DNA virus was detected in these isolates with CTAB method. There were dsRNA viruses in 11 isolates of 90A.fumigatusisolatesby CF-11 cellulose column chromatography, and there were 2 types of dsRNA viruses electrophoresis strip. There were dsRNA viruses in 24 isolates of 467A.flavusisolatesby CF-11 cellulose column chromatography, and there were 3 types of dsRNA viruses electrophoresis strip. There were dsRNA viruses in 9 isolates of 40A.nigerisolatesby CF-11 cellulose column chromatography, and there were only 1 type of dsRNA viruses electrophoresis strip. Conclusions:A.fumigatus,A.flavusandA.nigercarrya lot of dsRNA virus, which can provide the material for the study of related virus of the decline of aspergillus pathogenicity.

[Key words]aspergillus; antifungal agents; mycoviruses; dsRNA viruses; agarose gel electrophoresis； Guiyang

近年来，随着艾滋病等免疫受损人群的增加，肿瘤化疗、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，器官移植以及创伤性医疗操作等的增多，侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)的发病率急剧上升，曲霉成为仅次于念珠菌的第2常见侵袭性真菌病病原菌，并在引起肺部感染的真菌中占首位[1-5]。目前被发现的曲霉属有180余种，其中烟曲霉(A.fumigatus)是最主要的致病菌，其它还包括黄曲霉(A.flavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)和土曲霉(A.terreus)等[5]。烟曲霉感染的途径主要是通过呼吸系统，引起疾病的主要形式有过敏性支气管肺曲菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA)、曲霉肿(Aspergilloma)及侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis, IPA)等[6-8]。因真菌和人体细胞均为真核细胞，真菌抗生素类药物对人体的毒性更大，副作用也更强，随着两性霉素B、伏立康唑、米卡芬净等抗真菌药物广泛地用于临床，使得曲霉菌的耐药性逐年增加[9-10]。真菌病毒(fungal virus或mycovirus)是一类寄主为真菌的病毒，存在于各分类系统的真菌中[11-12]。部分真菌病毒的侵染能够使宿主真菌生长发育及致病性衰退(decline)或弱毒，因此真菌病毒具有治疗真菌感染的潜力[13]。本研究对贵阳市5所医院呼吸科病房空气中内曲霉菌种类携带真菌病毒进行调查，以期获得具有应用价值的真菌病毒。

1　材料与方法

1.1主要试剂

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取缓冲液(2%CTAB，2%PVP，100 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl)，2×GPS缓冲液(甘氨酸15.0 g，Na2HPO414.2 g，NaCl 35.1 g，调节pH=9.6，加水定容至1 000 mL)，10×STE(0.5 mol/L Tris，1 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，pH=7.0)，清洗缓冲液(10×STE 10 mL，95%乙醇17 mL，加DEPC-H2O定容至100 mL)，头孢霉素(上海生工公司)，CF-11纤维素(美国Sigma公司)，其它各种化学试剂为国产化学分析纯。

1.2方法

1.2.1曲霉菌株的分离及保存于2014-2015年从贵阳市5所医院的呼吸科病房空气中收集曲霉菌株。方法如下：将含有50 mg/L头孢霉素的PDA平板敞口置于病房，离病房地面约1 m，24 h后收集平板，于37 ℃恒温培养箱中培养，待菌落长出后，挑取单个菌落，对所有成功分离获得的菌株进行编号，并于PDA试管斜面上，4 ℃保存。

1.2.2曲霉菌菌丝的培养和收集将4 ℃保存的菌株，置于表面铺有玻璃纸的PDA平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养4 d后，刮取曲霉菌菌丝，于-80 ℃保存。

1.2.3真菌病毒DNA或dsRNA提取及检测CTAB方法提取DNA，将菌丝在液氨中研磨成粉，装入EP管中，加入65 ℃预热的CTAB缓冲液600 μL，混匀后65 ℃水浴30 min(中间混匀1～2次)；加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液(重复1次)；加入2倍体积的乙醇，-20℃沉淀1 h，12 000 r/min离心10 min，收集沉淀，用75%乙醇洗2次，风干后溶于去离子水中。纤维素吸附的方法提取dsRNA，将菌丝在液氨中研磨成粉，按每0.2 g菌丝依次加入2 × GPS 400 μL、Tris饱和酚(pH=8.0)400 μL、氯仿/异戊醇(24∶1)400 μL、10% SDS 92 μL，震荡混匀，12 000 r/min离心10 min，取600 μL上清液加入114 μL无水乙醇和0.04 g纤维素粉，震荡混匀，冰浴30 min；12 000 r/min离心1 min收集纤维素粉，加入600 μL清洗缓冲液，震荡混匀，静置3 min，12 000 r/min离心2 min，弃上清收集纤维素粉(重复1次)；加入600 μL 1×STE，震荡混匀，12 000 r/min离心5 min，取上清液，加入0.1倍体积的3 mol/L NaAc(pH=5.2)、等体积的异丙醇，-20 ℃下沉淀1 h；12 000 r/min离心15 min，收集沉淀，用75%乙醇洗1次，风干后溶于DEPC-H2O中。用1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭(0.5 μg/mL)染色检测各菌株中DNA和dsRNA的片段。

2　结果

2.1曲霉菌株的收集

共获得丝状真菌1 446株，曲霉菌株597株。其中黄曲霉菌株467株，烟曲霉菌株90株，黑曲霉菌株40株；各曲霉菌株的典型菌落和孢子头见图1，收集到的曲霉菌菌株分布见表1。

2.2597株曲霉菌中携带的真菌病毒类型

本研究未检测到DNA病毒(图2A)，但检测到dsRNA病毒(图2B)。对90株烟曲霉中所含有的真菌病毒进行检测，有11株烟曲霉含有dsRNA病毒，病毒电泳条带类型有2种，在2～4 kbp之间有4条dsRNA片段，在1～2 kbp之间有2条dsRNA片段(图2B泳道1和2)；对467个黄曲霉菌株进行真菌病毒检测，24个黄曲霉菌株含有dsRNA病毒，病毒电泳的条带类型有3种，在1～2 kbp之间有3条dsRNA片段(图2B泳道3和4)，在1～3 kbp之间有4条片段(图2B泳道5)；对40个黑曲霉进行真菌病毒检测，9个黑曲霉含有dsRNA病毒，病毒电泳条带类型只有1种(图2B泳道6)。

注：A为烟曲霉，B为黄曲霉，C为黑曲霉，D为烟曲霉孢子头(初期)，E为烟曲霉孢子头(后期)，F为黄曲霉孢子头(初期)，G为黄曲霉孢子头(后期)，H为黑曲霉孢子头图1　分离所得各曲霉菌的典型菌落和孢子头形态Fig.1　The colony morphology and conidiophores form of aspergillus

采集地病房数烟曲霉黄曲霉黑曲霉医院1131915822医院2100152医院3264867医院42282693医院52215196

3　讨论

在本研究中，在贵阳市5所医院呼吸科病房的空气中共分离获得597株曲霉菌，其中黄曲霉分离频率最高，烟曲霉次之，结果与国内研究一致[14-15]。有国外学者对医院环境进行监测，发现黑曲霉是医院环境最常见曲霉，这与本研究的结果不同[16-17]。在国内外学者的研究中，致病力最强的烟曲霉反而分离频率较低[14-17]。

真菌病毒大多数为dsRNA病毒，只有少数的DAN病毒[18-19]。本研究对597株曲霉进行真菌病毒检测，没有检测到DNA病毒，但检测到较多的dsRNA病毒。本研究还发现有些不同的曲霉菌株含有的dsRNA病毒的片段在分子量和数量是相同的，说明这些菌株可能携带同1种病毒；1个曲霉菌株中也存在多种类型的dsRNA片段，提示多种病毒可能混合侵染1个曲霉菌株。图2泳道1和2的电泳条带类型与烟曲霉中已经发现的真菌病毒的A.fumigatuschrysovirus和A.fumigatuspartitivirus-1的条带类型几乎一样，因此推断它们可能是同一种病毒[20]。本研究还发现其中一个病毒(图2B泳道3)的侵染，可能导致黄曲霉的性状发生变化，但是否对致病力产生影响，需要进一步实验验证。

综上，本研究发现在曲霉菌中存在着较多的真菌病毒，都为dsRNA病毒，未检出DNA病毒，为寻找曲霉菌致病力衰退相关病毒和利用病毒治疗曲霉菌感染提供了dsRNA病毒研究材料。

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(2016-03-01收稿，2016-07-10修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Investigation of Aspergillus Varities and Carrying Mycoviruses from in Respiratory Ward Air of 5 Hospitals in Guiyang City

JIANG Yinhui1, ZHANG Biao1, WU Changxue1, YUAN Qing2, GUAN Zhizhong1, ZHANG Tingting2

(1.MolecularBiologyKeyLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.CollegeofBiologicalEngineering,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou,China)

贵州省科技厅重大专项[黔科合计Z字(2012)4010]; 贵州医科大学博士启动基金[院博合J字(2014)035]; 贵州医科大学2015年高等学校大学生创新创业训练计划项目(201510660044)

Email:291066032@qq.com

R519

A

1000-2707(2016)08-0907-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.010

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网络出版时间：2016-08-23网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.038.html