阿托伐他汀对脂多糖诱导人主动脉内皮细胞细胞间黏附分子-1表达的影响*

嵇云鹏， 张彦燕， 杨　红,3， 石廷雨,3， 徐旖旎， 陶　玲， 沈祥春,3**

(1.贵州医科大学 天然药物资源优效利用重点实验室， 贵州 贵阳　550025； 2.贵州省人民医院 药剂科， 贵州 贵阳　550002； 3.贵州医科大学 中药药理教研室， 贵州 贵阳　550025)



·基础研究·

阿托伐他汀对脂多糖诱导人主动脉内皮细胞细胞间黏附分子-1表达的影响*

嵇云鹏1,2， 张彦燕1， 杨红1,3， 石廷雨1,3， 徐旖旎1， 陶玲1， 沈祥春1,3**

(1.贵州医科大学 天然药物资源优效利用重点实验室， 贵州 贵阳550025； 2.贵州省人民医院 药剂科， 贵州 贵阳550002； 3.贵州医科大学 中药药理教研室， 贵州 贵阳550025)

目的： 观察阿托伐他汀(Atv.)对脂多糖(LPS)诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响，并探讨其分子机制。方法： 用1 mg/L LPS复制HAECs损伤模型，通过MTT和乳酸脱氢酶(LDH)外漏率实验观察5 μmol/L Atv.对LPS诱导HAECs损伤的保护作用，采用RT-PCR法检测Atv.对ICAM-1 mRNA表达的影响，Western blot检测Atv.对ICAM-1、IκBα及NF-κB蛋白表达水平的影响。结果： 与LPS组比较，Atv.能有效抑制LPS诱导的HAECs损伤，细胞活力增加(P<0.01)，LDH外漏率减少(P<0.01)，Atv.可抑制LPS诱导的ICAM-1 mRNA(P<0.05)和蛋白表达上调(P<0.01)，还可抑制LPS诱导的IκBα蛋白表达水平的降低和phospho-NF-κ B p65蛋白表达水平的升高(P<0.01)。结论： 阿托伐他汀对LPS诱导HAECs损伤具有保护作用，并有效抑制ICAM-1的表达，该作用与抑制IκBα降解及NF-κB p65磷酸化有关。

阿托伐他汀； 人主动脉内皮细胞； 细胞间黏附分子-1； 核因子-κB

[Abstract]Objective: To observe the effect and mechanism of atorvastatin on the expression of ICAM-1 in lipopolysaccharide (LPS)-induced injury of cultured human aortic endothelial cells (HAECs). Methods: Cultured HAECs were treated with LPS alone (1 mg/L) or in the presence of atorvastatin (Atv.,5 μmol/L). MTT and LDH leakage ratio were used to analyze the protective effect of atorvastatin against LPS. The RT-PCR was used to determine the mRNA expression of ICAM-1. The western blot was adopted to detect the protein expression of ICAM-1, IκBα, NF-κB in HAECs injury induced by LPS. Results: Compared with LPS group, atorvastatin could effectively inhibit LPS-induced injury by increasing cell activity(P<0.01), decreasing LDH releasing ratio(P<0.01), inhibiting the up-regulating mRNA(P<0.05) and protein (P<0.01) expression of ICAM-1, inhibiting the decreasing of phospho-NF-κB p65 protein expression (P<0.01) and the increasing of IκBα protein expression (P<0.01). Conclusion: Atorvastatin has a protective effect on LPS induced HAECs injury, and can effectively inhibit the expression of ICAM-1, which is related to the inhibition of IκBα degradation and NF-κB p65 phosphorylation.

[Key words]atorvastatin; human aortic endothelial cells; intercellular adhesion molecule-1; nuclear factor-κB

细胞-细胞间黏附作用在多种刺激诱导的免疫应答中起重要作用。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)与整合素家族成员淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)及巨噬细胞分化抗原(Mac-1)结合，介导LFA-1阳性细胞发生黏附及其它生物学反应，在单核细胞与内皮细胞紧密黏附过程中发挥着极为重要的作用[1]。ICAM-1在脑缺血、帕金森、癌症等疾病ICAM-1表达异常升高，认为ICAM-1表达异常与肝癌、肺癌及结肠癌等肿瘤的发生发展有关[2-4]；研究还发现，动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块中和缺血再灌注损伤后的内皮细胞中ICAM-1表达也升高[5-6]，因此ICAM-1已成为预防和治疗多种疾病的潜在靶点。他汀类药物是目前临床广泛应用的调血脂药，除有调血脂的作用外，还具有改善血管内皮功能、抗炎及调节免疫功能等非调血脂的作用。阿托伐他汀(Atv.)具有血药浓度高、亲脂性及半衰期长等特点。本研究通过探讨Atv.对脂多糖(LPS)诱导人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells, HAECs) ICAM-1表达的影响，分析Atv.作用的分子机制，为Atv.发挥抗炎作用及临床作为非调血脂药物应用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

HAEC原代细胞购买自美国Science cell公司、内皮细胞培养基(ECM)、胰蛋白酶、中和液以及细胞冻存液(science cell research laboratories, USA)，Atv.标准品(中国食品药品检定研究院，Lot为100590-201303)，LPS(Escherichia coli 055，B5，Sigma，USA)，乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(南京建成生物工程研究所，Lot为20130806BCA)，蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，Lot为00041305)，总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，Lot为M1726)，逆转录试剂盒(thermo scientific，Lot为00132311)，Taq PCR Master Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司，Lot为13112606F)，ICAM-1抗体(Santa cruz，Lot为F0510)，兔抗IκBα抗体、phospho-NF-κ B p65抗体、NF-κ B p65抗体(Cell signaling technology)。

1.2方法

1.2.1HAECs培养参照Science cell公司指定培养条件、培养过程培养HAEC原代细胞。以5×107/L接种于培养瓶(板)内，5%CO2、37 ℃培养至细胞融合，用第4～5代细胞进行以下研究。

1.2.2分组及处理研究分为空白对照组、模型组及Atv.组，control组以无血清培养基处理，模型组采用 1 mg/L的 LPS处理培养12 h，Atv.组采用5 μmol/L的 Atv.预处理细胞1 h，然后加入1 mg/L的LPS后培养12 h，收集细胞进行后续研究。

1.2.3细胞损伤检测(1)MTT检测细胞存活率：取对数生长期的细胞消化后，调整细胞密度，以1×104/孔 细胞接种于96孔板；待细胞贴壁融合后弃去上清液，各组药物干预后，吸去培养液，每孔加入无血清DMEM 180 μL及MTT液20 μL，继续培养4 h，分离上清液，向细胞沉淀中加入150 μL DMSO低速振荡10 min，于490 nm波长处测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。(2)LDH外漏率：上清液LDH提取，取对数生长期的细胞接种于24孔板，各组药物干预1 h后，加LPS(1 mg/L)共同孵育12 h，吸取上清液，-20 ℃冰箱保存，以待检测；细胞内LDH提取，吸去上清后的细胞用PBS洗3遍，1% Triton-X100冰上裂解细胞20 min，取裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液，使用BCA试剂盒进行蛋白定量，计算胞内蛋白浓度，-20 ℃保存。根据LDH检测试剂盒说明书检测上清液和细胞内LDH含量，计算LDH外漏率。

1.2.4ICAM-1 mRNA检测采用RT-PCR法，将HAEC接种于6孔板培养，细胞融合后药物处理12 h，使用总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取细胞总RNA。以提取的RNA为模板，使用逆转录试剂盒(Thermo Scientific)合成cDNA， 由生工生物工程(上海)股份有限公司设计、合成ICAM-1引物，上游引物序列为5′-CCTCACACTTCACTGTCACCT-3′，下游引物序列为5′-CGTGCCGCACTGAACTGGAC-3′；内参对照GADPH上游引物序列为5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列为5′-AGGGGCATCCACAGTCTTC-3′。扩增条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共30次循环；72 ℃最后延伸2 min；共重复3次。扩增结束后，取1×TAE电泳缓冲液，配置1.8%琼脂糖凝胶溶液，加入无毒核酸染料，充分混匀，取5 μL PCR产物进行电泳，凝胶成像仪成像，Bandscan分析灰度值，以ICAM-1/GADPH表示各组ICAM-1 mRNA表达。

1.2.5ICAM-1 、NF-κ B及Iκ B α蛋白表达检测采用Western blot 法，取生长良好的HAECs，各组药物干预后，弃除含药培养基，预冷的PBS洗3遍，加入含PMSF的RIPA裂解液适量，冰上振荡20 min，刮下细胞，取裂解液于1.5 mL EP管内，4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清液，用BCA试剂盒蛋白定量后，-70 ℃保存。调整蛋白浓度，以含总蛋白40 μg的总体积20 μL体系上样。蛋白样品95 ℃变性5 min，用10%～12%的变性SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移至PVDF膜 (300 mA，2 h)。转膜后，5% 的脱脂牛奶 (TBST配制) 室温封闭1 h。加入一抗稀释液(ICAM-1 1∶200，IκBα 1∶1 000，phospho-NF-κ B p65 1∶1 000，NF-κ B p65 1∶1 000，β-actin 1∶5 000)，4 ℃孵育过夜。一抗孵育后，TBST洗涤3次，5 min/次，二抗稀释液(1∶6 000)室温孵育1～2 h，TBST洗涤3次，5 min/次，通过ECL化学发光法显色，Bio-Rad凝胶成像系统成像， Bandscan软件分析蛋白条带灰度强弱。

1.3统计学分析

2　结果

2.1各组HAECs细胞存活率与LDH外漏率

MTT结果表明(图1A)，LPS与HAECs作用12 h后，细胞活力较对照组细胞明显降低(P<0.01)。与模型组比较，Atv.组对LPS诱导HAEC损伤MTT值降低具有抑制作用 (P<0.01)。LDH外漏是细胞损伤的生物标志物之一，本研究结果显示(图1B)，与control组比较，模型组LDH外漏率明显增加 (P<0.01)；与模型组比较，Atv.组对可显著降低LDH外漏率(P<0.01)。

(1)与空白对照组比较，P<0.01； (2)与模型组比较，P<0.01图1　各组细胞存活率与LDH外漏率的影响Fig.1　Effect of Atv. on cell viability and LDH releasing ratio

2.2ICAM-1 mRNA及蛋白表达

结果显示，模型组ICAM-1 mRNA及蛋白表达明显增高(P<0.01)，Atv.可抑制LPS诱导的ICAM-1 mRNA(P<0.05)和蛋白表达上调(P<0.01)，见图2。

2.3NF-κ B及Iκ B α蛋白表达

与空白对照组比较，模型组HAECs中 IκBα蛋白表达明显降低(P<0.01)，phospho-NF-κ B p65表达明显升高(P<0.01)； Atv.组IκBα蛋白表达水平高于模型组，但低于空白对照组，phospho-NF-κ B p6蛋白表达水平低于模型组(P<0.01)，说明Atv.能抑制LPS 诱导的NF-κ B的激活。

3　讨论

Atv.作为3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，具有良好的调血脂作用，特别

(1)与空白对照组比较，P<0.01； (2)与模型组比较，P<0.01；(3)与模型组比较，P<0.05图2　Atv.对LPS诱导HAECs ICAM-1 mRNA及蛋白表达的影响Fig.2　Impact of Atv. on LPS induced ICAM-1 mRNA and protein levels, respectively

(1)与空白对照组比较，P<0.01； (2)与模型组比较，P<0.01图3　Atv.对LPS诱导HAECs中IκBα及phospho-NF-κ B p65蛋白表达的影响Fig.3　Impact of Atv. on LPS induced IκBα and phospho-NF-κ B p65 levels

是在高胆固醇血症的治疗中得到广泛应用。目前，Atv.仍主要用于心血管系统疾病的治疗，如高脂血症、急性冠脉综合症、冠状动脉介入治疗等[7]。Atv.的非调血脂作用近年来受到广泛关注，研究证实，通过抑制TLR4/NF-κB信号，Atv.能够改善糖尿病伴高血压大鼠血管内皮功能，对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠急性肠炎有保护作用[8-9]。体内、体外研究表明，他汀类药物亦具有抗癌活性[10]。

大量研究表明以抑制ICAM-1异常过表达为靶点，对于缓解炎症反应和免疫应答具有重要意义。本研究结果显示，Atv.能有效的抑制LPS诱导的HAECs ICAM-1转录(P<0.05)及蛋白表达水平(P<0.01)。核因子-κ B(NF-κ B)在炎症反应和免疫应答中起关键作用，其激活可以诱导多种炎症因子表达，是内皮细胞炎症信号的重要通路之一，在炎症反应应答、细胞黏附、组织细胞凋亡有关基因表达的调控中起关键作用。研究证实，ICAM-1的表达受到NF-κ B调控[11]。为阐明Atv.抑制ICAM-1表达的分子机制，本研究观察了与NF-κ B激活密切相关的蛋白IκB及磷酸化NF-κ B p65的表达情况。结果表明Atv.组较LPS组IκBα蛋白表达增加(P<0.01)，而磷酸化NF-κ B p65表达降低(P<0.01)，这表明，Atv.对ICAM-1表达的抑制作用与抑制NF-κ B的激活有关，而该作用与稳定IκBα，抑制NF-κ B p65磷酸化有关。

综上，Atv.对LPS 诱导的血管内皮细胞损伤具有保护作用，这可能与其抑制ICAM-1的表达有关。其对ICAM-1表达的抑制作用至少部分与抑制NF-κ B激活有关，这为Atv.抗炎作用提供了实验依据。但对Atv.在血管内皮细胞中调控NF-κ B信号通路的分子机制仍有待进一步研究。

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(2016-02-13收稿，2016-07-01修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Effect of Atorvastatin on the Expression of Intercellular Adhesion Molecule-1 in Cultured Human Aortic Endothelial Cells Induced by Lipopolysaccharide

JI Yunpeng1,2, ZHANG Yanyan1, YANG Hong1,3, SHI Tingyu1,3, XU Yini1, TAO Ling1, SHEN Xiangchun1,3

(1.TheKeyLab.ofOptimalUtilizationofNatrualMedicineResources,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofPharmacy,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China； 3.DepartmentofPharmacologyofTraditionalChineseMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

国家自然科学基金资助项目(81360650、81560811)； 贵州省留学人员科技活动项目[黔人资合(2013)02号]； 贵州省高层次创新型人才[黔科合人才(2015)4029号]； 贵阳市现代药业计划[筑科合同(2011204)17号]； 贵州省中药现代化专项[黔科合中药字(2012)5051号]； 贵州省高等学校创新团队[黔教合人才团队(2014)31号]； 贵州省创新团队[黔科合人才团队(2015)4025号]

Email:shenxiangchun@126.com

R96

A

1000-2707(2016)08-0882-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.004

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网络出版时间：2016-08-23网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.036.html