Bmi-1在口腔鳞癌组织中的表达及意义*

刘庭庭， 马　洪， 段晓峰

(贵州医科大学 口腔医学系， 贵州 贵阳　550004)



Bmi-1在口腔鳞癌组织中的表达及意义*

刘庭庭， 马洪**， 段晓峰

(贵州医科大学 口腔医学系， 贵州 贵阳550004)

目的： 探讨Bmi-1基因在口腔鳞癌组织中的表达及意义。方法： 收集口腔鳞癌(OSCC)患者手术切除新鲜标本30例作为OSCC组，癌旁0.5 cm外正常组织及正常体检者的口腔黏膜组织共30例作为正常对照组，免疫组织化学染色SP法检测两组组织中Bmi-1蛋白的表达，实时定量基因扩增荧光检测系统(QPCR)检测Bmi-1 mRNA的表达，比较不同临床理特征OSCC患者Bmi-1的表达差异。结果： OSCC组织中，Bmi-1蛋白和mRNA的表达明显高于正常对照组；在OSCC组织中，中低分化的OSCC组织的Bmi-1蛋白和mRNA表达高于高分化OSCC组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，Bmi-1表达与患者年龄、性别无关(P>0.05)。结论： Bmi-1基因检测可作为OSCC的辅助诊断指标之一。

Bmi-1； 基因； 口腔肿瘤； 癌,鳞状细胞； 免疫组织化学

[Abstract]Objective: To explore the Bmi-1 gene expression and clinical significance in oral squamous carcinoma(OSCC) tissues. Methods: Fresh tissue samples of 30 patients with oral squamous cell carcinomas were collected as OSCC group, while 30 cases of 0.5 cm normal tissue adjacent to carcinoma and normal physical examination were taken as the normal control group. The expression of Bmi-1 protein in the two groups was detected by immunohistochemistry SP method, and the expression of mRNA Bmi-1 was detected by real-time quantitative PCR. Results: The expression of Bmi-1 protein and mRNA in OSCC tissue were significantly higher than those in normal control group. In OSCC tissues, the expression of Bmi-1 protein and mRNA in the low and middle differentiated OSCC tissues were higher than those in the highly differentiated OSCC tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). BMI-1 expression was not related to patient's age and sex. Conclusion: Bmi-1 gene detection can be used as one of the auxiliary diagnostic indicators of oral squamous cell carcinomas.

[Key words]Bmi-1; gene; mouth neoplasms; carcinoma; squamous cell，immunohistochemistry

PcG蛋白-多梳家族蛋白(polycomb groupprotein)是一类在染色质水平抑制靶基因转录的蛋白，在胚胎发育、细胞记忆、细胞周期、细胞增殖和肿瘤形成等过程中起到非常重要的作用。B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点(B-cell-speciifc moloney murine leukemia virus integration site 1，Bmi-1)是目前研究中最深入的哺乳动物PcG家族成员。近年来，越来越多的证据表明 ，Bmi-1在恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。Bmi-1在很多肿瘤中处于高表达的状态，如髓母细胞瘤[1]、非霍奇金淋巴瘤[2]、肝癌[3]、结直肠癌[4]、乳腺癌[5]等,本研究通过检测口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)组织中Bmi-1的表达，并比较OSCC不同临床病理特征患者Bmi-1表达的差异，为OSCC的临床早期诊断、生物蛋白靶向治疗及预后监测判断提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源2012年9月～2015年3月手术切除OSCC患者30例作为OSCC组，男22例，女8例，高分化22例、中低分化8例；无淋巴结转移25例、有淋巴结转移5例。术前未采用任何针对肿瘤的治疗(放疗、化疗等)，术中用尖刀切取标本后，盐水冲洗，置-80 ℃冰箱保存；术后常规病理检查确诊为OSCC。选择口腔黏膜正常组织及癌旁0.5 cm正常组织(经病理证实无癌累及)共30例作为正常对照组。

1.1.2主要试剂及设备小鼠抗人Bmi-1单克隆抗体(Abcam公司)，SP免疫组化二抗试剂盒-通用型、苏木素及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，mRNA抽提试剂盒Dynabeads ®mRNA DIRECTTM、逆转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR扩增试剂 Light Cycler®480 SYBR Green ⅠMaster购自Roche公司，CFX connect Real Time System PCR仪。

1.2方法

1.2.1Bmi-1蛋白表达采用免疫组织化学染色SP法，组织蜡块切成厚5 μm连续切片，脱蜡水化后，3%去离子过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶，高压锅波热处理修复抗原，正常山羊血清封闭特异性抗原，加入Bmi-1一抗工作液、4 ℃孵育过夜，加入生物素二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固；PBS代替一抗，做阴性对照，实验程序严格按照试剂说明书进行。各组切片在光镜下观察、评分及病理图像采集[6-7]，每个样本观察 10 个高倍镜视野。根据阳性强度及面积记分，无色记0分，淡黄色记1分，棕黄色及以上记2分；着色面积<1/3、1/3～2/3和>2/3 分别为0、1和2 分；0～1 分为阴性，2～3 分为阳性(+)，4 分为强阳性(++)。

1.2.2Bmi-1 mRNA表达采用实时定量基因扩增荧光检测系统(real-time quantitative PCR detecting system，QPCR)，利用磁珠法提取组织mRNA，从存储在RNALATER试剂(-80 ℃)的组织中切取1～2 mm3组织，加入蛋白溶解酶K，55 ℃恒温箱中消化完全后，加入40 μL Dynabeads dT25，置摇床10 min，立即放入磁场中，移除上清液并用BufferA/B液顺次洗涤。加入Tris-HCL，溶解磁珠并放入80 ℃恒温箱2 min，将收集来的大约13 μL mRNA(在Tris-HCL中的)直接加入事先准备好的7.5 μL cDNA Synthesis Master Mis中。将样品放入热循环仪中，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，-20 ℃储存备用。将上述合成的cDNA上样至10 μL反应体系：SYBR Green ⅠMaster 5.0 μL，上下游引物 4.0 μL，模板1 μL，用CFX connect Real Time System PCR仪进行扩增，反应条件为预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 10 s，退火65 ℃ 30 s，共64个循环[8]。每个样品3个复孔，取CT平均值，采用相对定量法分析结果。

1.3统计学方法

用SPSS 16.0软件进行统计学分析，率的比较采用四格表资料的χ2检验，不符合正态分布资料间的比较采用非参数秩和检验或χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Bmi-1的蛋白表达

免疫组化结果显示Bmi-1主要着色于细胞核内，为棕黄色染色颗粒，在正常组织中几乎无阳性表达，见图1。OSCC组中，Bmi-1蛋白的阳性表达率均高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。临床病理分析显示，Bmi-1的表达随着肿瘤体积增大而升高，阳性率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；随着临床分期的进展，Bmi-1蛋白在OSCC组织中的表达也升高，差异有统计学意义(P<0.05)；OSCC组织中，Bmi-1蛋白表达与患者年龄、性别无关，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

正常口腔黏膜　　　　　　　　　　 　　　　　　OSCC黏膜图1　正常口腔黏膜及OSCC组织中Bmi-1蛋白表达(SP法, ×100)Fig.1　Bmi-1 protein expression in tissue

分组 Bmi-1蛋白表达n-+++ 阳性率(%)χ2P正常对照组30217230.017.38<0.01OSCC组 305151083.3

2.2Bmi-1 mRNA表达

30例OSCC组织中Bmi-1 mRNA表达(平均秩和45.50)高于正常对照组(平均秩和15.50),差异有统计学意义(Z=-6.666，P<0.01)。在OSCC组织中，Bmi-1 mRNA的表达随着肿瘤体积增大而升高，中低分化组表达高于高分化组，差异有统计学意义(P<0.05)；Bmi-1 mRNA表达与患者年龄、性别无关,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3　讨论

已知在多种肿瘤中存在一类具有自我更新和多向分化潜能的肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)。Bmi-1与CSC的自我更新及肿瘤的放化疗敏感性都有关系，降低 Bmi-1的表达可以促进肿瘤细胞的凋亡和衰老,并增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，Bmi-1可能为肿瘤治疗的一个重要靶点[9-10]。有研究发现，Bmi-1的特异性表面标志用于头颈部鳞癌干细胞的检测和治疗方案的制定，能使健康人类口腔角质细胞的寿命延长[11-12]，提示Bmi-1在鳞癌组织发生、发展及治疗中起重要作用。本课题通过对OSCC组织中Bmi-1表达情况进行检测，发现在OSCC患者口腔黏膜中Bmi-1蛋白的表达主要在基底细胞层，阳性表达率为83.3%，高于文献报道的79.0%[13]，这可能与样本的数量有关；同时本实验还发现，在OSCC组织中Bmi-1基因的表达高于正常对照组，且Bmi-1的高表达与临床分期及淋巴结转移成正相关，提示Bmi-1在口腔鳞癌发生浸润转移过程中也起重要作用，其发生机制需进一步研究。综上所述，Bmi-1基因检测可作为OSCC的辅助诊断指标之一，研究Bmi-1在OSCC中的表达与OSCC的相关性及协同作用，可为OSCC的临床诊断、预防、生物蛋白靶向治疗及预后监测判断等提供理论基础。

表2　不同临床病理参数OSCC患者口腔黏膜组织Bmi-1蛋白表达

(1)同病理参数下的各指标比较，P<0.05

表3　不同临床特征OSCC患者口腔黏膜Bmi-1mRNA表达比较

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(2016-02-05收稿，2016-05-15修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华

Bmi-1 Expression and its Clinical Significance in Oral Squamous Carcinoma Tissues

LIU Tingting, MA Hong, DUAN Xiaofeng

(DepartmentofOralMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

贵阳市科技局社会发展项目科研基金一项[筑科合同(2013103)]

Email:mahong1966@126.com

R739.8

A

1000-2707(2016)08-0942-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.019

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网络出版时间：2016-08-23网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.058.html