激活星形胶质细胞α7胆碱能受体后内源性Cryab蛋白的表达*

任真奎， 何　婧, 吴昌学， 官志忠， 禹文峰

(贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳　550004)



激活星形胶质细胞α7胆碱能受体后内源性Cryab蛋白的表达*

任真奎， 何婧, 吴昌学， 官志忠， 禹文峰**

(贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004)

目的： 探讨尼古丁激活SD大鼠星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 nAChRs)后内源性B-晶状体蛋白(Cryab)表达。方法： 分离24 h新生乳鼠大脑皮质，原代培养并鉴定为星形胶质细胞后，将培养第3～4代的星形胶质细胞分为正常对照组、尼古丁处理组和α7 nAChRs阻断剂 (MLA)联合尼古丁处理组；正常对照组不加尼古丁和MLA，尼古丁处理组以1、5及10 μmol/L浓度的尼古丁处理星形胶质细胞6、12、18及24 h，MLA联合尼古丁处理组以0.05、0.1、0.15及0.2 μmol/L浓度的MLA预先处理星形胶质细胞2 h后，再加入尼古丁处理组最佳浓度的尼古丁和最佳培养时间培养细胞；运用蛋白印迹(Western blotting)方法检测3组星形胶质细胞内源性Cryab蛋白的表达。结果： 与正常对照组比较，尼古丁处理组的星形胶质细胞内源性Cryab蛋白上调(P<0.05)；与尼古丁处理组比较，MLA联合尼古丁处理组的星形胶质细胞内源性Cryab蛋白上调受到明显抑制(P<0.01)。结论： 尼古丁激活星形胶质细胞α7nAChRs可上调内源性Cryab蛋白表达，该表达可被MLA阻断。

星形胶质细胞； B-晶状体蛋白； α7胆碱能受体； 尼古丁； 阿尔茨海默氏病

[Abstract]Objective: To investigate the expression of endogenous Cryab protein after the activation of α7 nAChRs by nicotine in SD rat astrocytes. Methods: The rat cerebral cortex of 24 h neonatal was isolated. After primary culture and identification of astrocytes, the astrocytes cultivated for 3～4 generation were divided into normal control group, nicotine treatment group and α7 nAChRs blocking agent (MLA) plus nicotine treatment group. Normal control group did not receive nicotine and MLA, 1, 5 and 10 μmol/L nicotine was used to treat astrocytes for 6, 12, 18 and 24 h in nicotine treatment group, and in MLA plus nicotine treatment group 0.05, 0.1, 0.15 and 0.2 μmol/L MLA treated astrocytes for 2 h previously and nicotine of optimal concentration was used to cultivate the astrocytes in optimal cultivation time. Western blotting was used to detect the expression of endogenous Cryab protein in astrocytes the three groups. Results: Compared with normal control group, the endogenous Cryab protein expression up-regulated significantly in nicotine treatment group(P<0.05). Compared with nicotine treatment group, the up-regulation of endogenous Cryab protein expression in MLA plus nicotine treatment group was significantly inhibited(P<0.01). Conclusions: The activation of α7 nAChRs of astrocytes by nicotine can up-regulate endogenous Cryab protein expression, which can be blocked by α7 nAChRs blocker MLA.

[Key words]astrocytes; Cryab; α7 cholinergic receptor; nicotine; Alzheimer's disease

B-晶状体蛋白(Cryab)是一类分子伴侣蛋白，属于小分子热休克蛋白家族成员，广泛地分布在脑组织中，并且主要在星形胶质细胞(astrocyte，AS)和少突胶质细胞内表达[1]。在中枢神经系统，Cryab具有抗凋亡和神经保护的生理功能[2]。在阿尔茨海默病(alzheimer’s disease, AD)大脑中，星形胶质细胞表达的Cryab蛋白明显上调，并且这些上调的Cryab蛋白紧密地分布在β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)沉积周围[3]。Aβ的异常聚集是AD的主要的病理特征之一[4]，Aβ的异常聚集可以导致突触功能障碍、慢性炎症及细胞凋亡等[5]。有研究表明，Cryab蛋白能够通过与Aβ蛋白直接结合等方式有效地阻止Aβ蛋白的聚集及其细胞毒性作用[6-7]。α7胆碱能受体(α7 nicotinic receptors,α7 nAChRs)对改善AD的学习和认知障碍有显著作用。课题组近期研究表明，用尼古丁激活星形胶质细胞α7 nAChRs后能显著抑制Aβ的聚集，但具体机制尚不清楚。基于Cryab蛋白能抑制Aβ蛋白的聚集及其细胞毒性的特性，因此推测星形胶质细胞内源Cryab蛋白可能是尼古丁介导Aβ聚集的中间环节， Cryab蛋白可能是AD的一种潜在治疗靶点。

1　材料与方法

1.1材料及试剂

新生24～48 h内的SD(Sprague-Dawley)大鼠由贵州医科大学动物实验中心提供。胎牛血清及DMEM培养基购于美国Gibco公司，α7nAChRs阻断剂(methyllycaconitine，MLA) 购于美国Sigma公司，青-链霉素及胰蛋白酶购于美国Hyclone公司；DMSO购自美国Sigma公司，鼠抗Cryab(αB-crystallin)单克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔、抗鼠二抗、鼠抗β-肌动蛋白 (β-actin) 单克隆抗体、抗体稀释液以及封闭液、聚丙烯酰胺凝胶购自碧云天公司；高效显影胶片、显影液以及定影液购自柯达公司，ECL-Plus试剂及聚乙烯二氟(PVDF)膜购于美国Millipore公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2方法

1.2.1星形胶质细胞培养及传代取24～48 h内新生SD乳鼠的大脑皮质剪成泥状，消化漂洗后，加入含1%双抗(青霉素100 000 U/L，链霉素100 000 U/L)、10%血清(FBS)的高糖DMEM培养基，吹打成细胞悬液，接种至培养瓶，5%CO2、37 ℃恒温培养。24 h后换液，之后每3 d换1次液，直至细胞铺满瓶底。培养8 d左右，纯化并传3～4代。

1.2.2分组及处理将培养第3～4代星形胶质细胞分为正常对照组、尼古丁处理组和MLA联合尼古丁处理组，尼古丁处理组以1、5及10 μmol/L浓度的尼古丁处理星形胶质细胞6、12、18及24 h，观察不同浓度尼古丁处理星形胶质细胞不同时间点时Cryab蛋白表达水平；MLA联合尼古丁处理组以0.05、0.1、0.15及0.2 μmol/L浓度的MLA预先处理星形胶质细胞2 h后，选择上调Cryab蛋白表达水平最高的尼古丁浓度(尼古丁组)加入最佳时间(尼古丁组)培养细胞；正常对照组不给于尼古丁和MLA处理。

1.2.3Cryab蛋白表达采用蛋白印迹法(Western blotting)，从6孔板中收集细胞，加入细胞裂解液裂解(100 μL/孔)，在4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清(含蛋白质)用BCA蛋白定量试剂盒定量后分装-80 ℃保存，用Western blotting方法检测Cryab蛋白表达水平。12%的SDS-PAGE电泳分离5 μg 上样量的蛋白样品，转移至PVDF膜，5%BSA室温封闭1 h，TBS-T漂洗3次， 10 min/次，加入相应一抗，4℃孵育过夜，TBS-T漂洗3次， 10 min/次，加入辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，TBS-T漂洗3次， 10 min/次，曝光。以β-actin蛋白为内参，用Image J软件分析Cryab蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度。

1.3统计学分析

所有数据用 SPSS 22.0 统计软件处理，数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1尼古丁显著上调Cryab蛋白表达水平

与对照组比较，1、5及10 μmol/L尼古丁刺激星形胶质细胞6、12、18及24 h可使Cryab(21 kD)蛋白表达水平升高，以5 μmol/L尼古丁浓度刺激18 h时升高最为明显(P<0.05)，见图1。

2.2尼古丁通过激活α7 nAChRs上调Cryab蛋白水平

用0.05、0.1、0.15及0.2 μmol/L α7 nAChRs阻断剂MLA预处理星形胶质细胞2 h，再加入尼古丁5 μmol/L培养18 h后，与尼古丁处理组比较， Cryab蛋白(21 kD)的表达均受到抑制(P<0.05)。证实尼古丁是通过激活α7 nAChRs而上调Cryab蛋白表达水平。

(1)表示与正常对照组比较，P <0.05图1　尼古丁对AS中Cryab蛋白表达影响Fig.1　 Effect of Nicotine on the expression of Cryab protein

(1)与正常对照组比较，P <0.05；(2)与尼古丁处理组比较，P <0.01图2　MLA对AS中Cryab蛋白表达的影响Fig.2　Effect of MLA on the expression of Cryab protein

3　讨论

随着人口进入老年化，AD的发病趋势越来越严重。在AD的致病机制中，Aβ的聚集和沉积是其核心机制。Aβ的聚集和沉积不仅可以导致神经细胞凋亡，也可以破坏突触结构和功能，从而导致记忆和认知功能障碍[9]。此外，Aβ的聚集和沉积能够激活小胶质细胞和星形胶质细胞释放细胞因子，炎性因子等炎症介质从而导致脑内的神经炎症[10]。所以，阻止Aβ的聚集，对防治AD具有重要意义。在中枢神经系统中主要的胶质细胞是星形胶质细胞，星形胶质细胞在中枢神经系统具有支持和隔离、调节细胞离子浓度、调节神经递质的释放、营养修复、抗氧化、形成和维持血脑屏障等多种生理功能[11-12]。Aβ的异常沉积形成的老年斑为AD的突出病理特征，在正常的中枢神经系统中Aβ主要由神经元产生，并能通过相应的途径自动清除，来源和去路维持一定的动态平衡，当平衡被破坏时不可溶的Aβ纤维沉积形成淀粉样斑块[13]。活化的星形胶质细胞能够对Aβ进行有效的吞噬和降解，但激活的星形胶质细胞又能够导致AD脑内的神经炎症发生[14]。神经型尼古丁受体广泛分布于中枢神经系统，α7 nAChRs在皮层神经元中高表达而且是其中较为特殊的亚型，激活的α7 nAChRs参与多种生理调节外，还对改善神经退行性疾病，特别是AD的学习和认知障碍有显著作用[15-16]。但是，有关星形胶质细胞α7 nAChRs的功能，特别是它调控星形胶质细胞对Aβ聚集和沉积的研究目前尚未见到报道。

本研究旨在用尼古丁刺激星形胶质细胞的α7 nAChRs后，观察其对内源性Cryab蛋白表达的影响。结果发现尼古丁刺激星形胶质细胞后，能上调内源性Cryab蛋白表达。并且先加入MLA处理星形胶质细胞2 h后，再加入尼古丁共同孵育18 h发现尼古丁上调内源性Cryab蛋白表达的效应能被α7 nAChRs的阻断剂MLA抑制；说明尼古丁是通过星形胶质细胞的α7 nAChRs而上调内源性Cryab蛋白。课题组近期结果也表明，用尼古丁刺激星形胶质细胞后能显著抑制Aβ的聚集，Cryab蛋白能够通过与Aβ蛋白直接结合等方式有效地阻止Aβ的聚集及其细胞毒性作用[16]。说明Cryab蛋白可能是抑制Aβ聚集的一个重要环节。为进一步研究Cryab蛋白可能是AD的一个潜在治疗靶点提供了重要依据。

[1]Zhu Z, Li R, Stricker R, et al. Extracellular α-crystallin protects astrocytes from cell death through activation of MAPK, PI3K/Akt signaling pathway and blockade of ROS release from mitochondria[J]. Brain Research, 2015(1620):17-28.

[2]Ousman SS, Tomooka BH, Noort JMV, et al. Protective and therapeutic role for αB-crystallin in autoimmune demyelination[J]. Clinical Immunology, 2007 (Suppl):S139.

[3]Wilhelmus MMM, Waal RMW, Verbeek MM. Heat shock proteins and amateur chaperones in amyloid-beta accumulation and clearance in Alzheimer’s Disease[J]. Molecular Neurobiology, 2007 (3):203-16.

[4]Toledo JB, Bjerke M, Da X, et al. Nonlinear association between cerebrospinal fluid and florbetapir f-18 β-amyloid measures across the spectrum of Alzheimer Disease[J]. Jama Neurology, 2015 (5):78-85.

[5]Ittner LM, Ke YD, Delerue F, et al. Dendritic function of tau mediates amyloid-β Toxicity in Alzheimer's Disease mouse models[J]. Cell, 2010 (3):387-397.

[6]Dehle FC, Heath E, Musgrave IF, et al. αB-Crystallin inhibits the cell toxicity associated with amyloid fibril formation by κ-casein and the amyloid-β peptide[J]. Cell Stress & Chaperones, 2010 (6):1013-1026.

[7]Shammas SL, Waudby CA, Wang S, et al. Binding of the molecular chaperone αB-crystallin to Aβ amyloid fibrils inhibits fibril elongation[J]. Biophysical Journal, 2011 (7):1681-1689.

[8]Wilhelmus MM， Boelens WC， Otte-Höller I，et al. Small heat shock proteins inhibit amyloid-β protein aggregation and cerebrovascular amyloid-β protein toxicity[J]. Brain Research, 2006(4):67-78.

[9]Fu W, Shi D, Westaway D, et al. Bioenergetic mechanisms in astrocytes may contribute to amyloid plaque deposition and toxicity[J]. Journal of Biological Chemistry, 2015(20):98-105.

[10]Heneka MT, M Kerry O, Dick T, et al. Inflammatory processes in Alzheimer's disease[J]. Journal of Neuroimmunology, 2007 (1-2):69-91.

[11]Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology[J]. Acta Neuropathologica, 2010 (1):7-35.

[12]张敬军.星形胶质细胞的研究[J].中国药理学通报, 2006(7):788-791.

[13]Béduer A, Joris P, Mosser S, et al. Detection of Alzheimer's disease amyloid-beta plaque deposition by deep brain impedance profiling[J]. Journal of Neural Engineering, 2015 (2):78-85.

[14]Rodríguez JJ,Olabarria M,Chvatal A ,et al. Astroglia in dementia and Alzheimer's disease[J]. Cell Death & Differentiation, 2009(8):378-385.

[15]Russo P, Del Bufalo A, Frustaci A, et al. Beyond acetylcholinesterase inhibitors for treating Alzheimer's disease: α7-nAChR agonists in human clinical trials[J].Current Pharmaorutioal Design, 2014 (38):6014-6021.

[16]Corinne B, Tristan R, Samuel D. Banister,et al.Structure-activity relationship studies of SEN12333 analogues: Determination of the optimal requirements for binding affinities at α7 nAChRs through incorporation of known structural motifs [J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2015(95):277-301.

(2016-02-11收稿，2016-07-08修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

Endogenous Cryab Protein Expression after Activation of α7 nAChRs of Astrocytes

REN Zhenkui, HE Jing, WU Changxue, GUAN Zhizhong, YU Wenfeng

(KeyLabofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

国家自然科学基金(81360199); 教育部科学技术研究项目(213032A); 贵州省国际科技合作项目[黔科合外G字(2013)7026号]

Email:wenfengyu2013@126.com

R34-33

A

1000-2707(2016)08-0874-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.08.002

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网络出版时间：2016-08-23网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160823.1343.030.html