全反式维甲酸联合顺铂在诱导人头颈癌TCA8113细胞凋亡中的作用

孙　强，邱　峰,赵军方，方　政，李新明，孙明磊

(1.郑州大学第一附属医院口腔颌面外科，河南 郑州 450052；2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)



全反式维甲酸联合顺铂在诱导人头颈癌TCA8113细胞凋亡中的作用

孙强1,2，邱峰1,赵军方1，方政1，李新明1，孙明磊1

(1.郑州大学第一附属医院口腔颌面外科，河南 郑州 450052；2.河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

目的研究全反式维甲酸(ATRA)与顺铂对人头颈癌TCA8113细胞凋亡的影响。方法ATRA和顺铂单独及联合作用于TCA8113细胞，采用MTT法检测细胞生长，并观察细胞形态变化；使用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡；通过western blot实验检测caspase-3表达情况。结果ATRA作用于TCA8113细胞后，细胞生长明显受到抑制，细胞形态发生改变，细胞凋亡比例明显增加，caspase-3蛋白表达下调，ATRA与顺铂联合作用于肿瘤细胞后，其抑癌作用加强。结论ATRA联合顺铂对人头颈癌TCA8113细胞具有协同抑癌作用。

TCA8113细胞；全反式维甲酸；顺铂；细胞凋亡

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and cisplatin on the proliferation of human head and neck cancer TCA8113 cells.MethodsTCA8113 cells were treated with ATRA and (or) cisplatin respectively.Cell proliferation was detected by the method of MTT.Cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThe growth of the cells treated with ATRA was inhibited obviously and the morphology of the cells were changed.The apoptosis rate of TCA8113 cells was increased gradually and the effect was enhanced when combined ATRA with cisplatin.ConclusionATRA could inhibit the proliferation of human head and neck cancer TCA8113 cells and the inhibitory effect was synergistic when ATRA combined with cisplatin.

[Key words]TCA8113 cells; all-trans retinoic acid; cisplatin; cell apoptosis

头颈部中最常见的恶性肿瘤病理类型为鳞癌，约占成人病例数的90%[1]。头颈部恶性肿瘤的发生率较高，位居全身恶性肿瘤的第6位，化疗目前仍是提高恶性肿瘤生存率和生活质量最有效的方法，因此寻找针对恶性肿瘤特异性的低毒、高效药物是重要的研究方向。全反式维甲酸全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)最初用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，近年来已有报道其在实体瘤治疗方面作用明显。顺铂是铂类抗肿瘤化合物，是临床常用化疗药物。根据2种药物的不同作用机制，其联合用药于头颈鳞癌是否能够起到协同抑癌作用，目前尚未见明确报道。本研究旨在研究ATRA与顺铂联合应用于人头颈癌TCA8113细胞的协同抑癌作用。

1　材料与方法

1.1材料顺铂(南京制药厂有限公司)用去离子水配制成1 mg·mL-1溶液，过滤除菌，4 ℃冷藏贮存。ATRA(美国Sigma公司)避光下用无水乙醇配制成10-2mol·L-1，过滤除菌，-20 ℃冰箱避光贮存备用。MTT(美国Sigma公司)用PBS液配制成5 mg·mL-1，过滤除菌，4 ℃冰箱贮存备用。TCA8113细胞由上海交通大学医学院附属第九人民医院提供。

1.2方法

1.2.1细胞培养细胞在37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2MTT检测分为4组：对照组(1 mL·L-1的无水乙醇)、ATRA组(10-5mol·L-1)、顺铂组(70 mg·L-1)和联合组(ATRA终浓度为10-5mol·L-1，顺铂终浓度为70 mg·L-1)。用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，以5 000个/孔接种于96孔板，每组细胞设4个复孔。连续培养6 d，每隔24 h去除上清，加入20 μL 5.0 mg·mL-1浓度的MTT溶液，继续培养4 h。吸去上清，加入200 μL二甲基亚砜。震荡10 min，酶联免疫标记仪设定波长为490 nm，检测各孔光密度(OD)值。实验重复3次。绘制细胞生长曲线。

1.2.3流式细胞仪检测收集细胞1×106·mL-1，预冷PBS洗2次。用PBS稀释乙醇至70%浓度，加入1 mL，4 ℃过夜固定。PBS洗1次，弃尽液相。加入400 μL PI/RNase Staining Buffer,避光孵育15 min。流式细胞仪检测，使用488 nm激发光，Cellquest软件收细胞至10 000个，ModFitLT软件分析细胞周期。

1.2.4Western blot检测收获指数生长期细胞的蛋白，测定蛋白浓度。配制质量分数10%分离胶聚丙烯酰胺凝胶，转膜使用电流300 mA，2 h，质量分数5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜，D2-40和β-actin一抗在摇床孵育4 h。二抗孵育1 h，化学发光Western blot分析试剂盒：ECL Plus Western blot检测试剂盒(英国Amersham公司),实验重复3次。

2　结果

2.1细胞形态学变化显微镜下观察可见24 h时对照组肿瘤细胞生长良好，呈多边形，胞体透亮；ATRA作用组细胞在24 h时细胞挛缩成圆形，胞内颗粒增多；48 h时，实验组大量细胞呈圆形悬浮状态，少量细胞贴壁生长，部分细胞断裂成碎片；72 h时，实验组大量细胞呈漂浮状态，大量细胞裂解并碎片形成。

2.2顺铂、ATRA对TCA8113细胞的生长抑制作用MTT法测定细胞增殖活性：ATRA可以抑制TCA8113细胞增殖活性，在48 h时抑制最为明显；与顺铂联用后增殖活性明显降低(P<0.05)。到第6天，细胞生长进入平台期。见图1。

图1　ATRA及顺铂对TCA8113细胞增殖活性的抑制作用

2.3ATRA及顺铂对TCA8113细胞周期及细胞凋亡的影响流式细胞仪检测显示： 对照组细胞处于G2/M期比例明显高于药物处理组；药物联用后出现G0/G1期和G2/M期阻滞，明显促进TCA8113细胞凋亡(P<0.05)。见表1。

2.4ATRA及顺铂作用于TCA8113细胞后对细胞凋亡蛋白caspase-3表达的影响Western blot实验显示ATRA及联合用药作用于细胞后可见caspase-3总蛋白明显减少，说明处于功能激活状态的caspase-3剪切体增多，进而说明ATRA及联合用药组抑癌作用的机制是通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。见图2。

图2　ATRA及顺铂对TCA8113细胞caspase-3表达的影响

组别G0/G1SG2/M细胞凋亡率/%对照组45.37±1.9848.41±3.146.22±1.666.77±1.27ATRA组54.44±2.6933.31±3.461)12.25±2.0119.50±2.041)顺铂组40.31±0.7636.80±1.751)22.89±1.761)23.43±3.221)联合组48.78±2.481)3)32.75±1.641)3)18.47±2.221)2)33.78±2.211)2)3)

注：与对照组比较，1)P<0.05；与ATRA组比较，2)P<0.05；与顺铂组比较，3)P<0.05。

3　讨论

文献报道很多抗肿瘤药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥作用的，ATRA是一种的分化诱导剂，在肿瘤细胞生长、分化中发挥重要作用，研究提示其能诱导多种肿瘤细胞凋亡，在多种恶性肿瘤如白血病、甲状腺癌、肝癌、大肠癌等起到重要抗肿瘤作用[2-7]。增殖活性是细胞生物学特性的基本参数之一，本结果提示ATRA组的增殖活性抑制在48 h和72 h较对照组明显增强，说明ATRA对TCA8113细胞有明显增殖活性抑制作用。在本实验中观察到药物联合组的抑制率与单药相比，72 h时协同抑制增殖活性明显，这表明ATRA与顺铂联合用药具有协同抑癌作用。

细胞周期的调控在肿瘤的发生中有着重要的作用[4]，细胞增殖和凋亡调节失控对肿瘤生物学行为有着重要的影响，研究表明ATRA对肿瘤细胞可以产生G1期阻滞[8]，而高浓度的顺铂可导致肿瘤细胞出现G2/M期阻滞[9]。本实验中发现ATRA作用于TCA8113细胞后,G0/G1期的细胞比增加，S期的肿瘤细胞比率下降,而ATRA联合顺铂用药作用于TCA8113细胞后G0/G1期和G2/M期肿瘤细胞比率均增加，说明联合用药后TCA8113细胞DNA合成和有丝分裂受阻。单一用药作用于TCA8113细胞后发现各组的凋亡率与对照组比较差异均有统计学意义，联合用药与ATRA组、顺铂组相比，凋亡率明显提高。

本研究对用药后凋亡率提高的机制进行进一步研究，caspase-3的激活通常被作为细胞凋亡的一个重要指标，其是细胞凋亡过程中的关键的执行分子[10]。Caspase-3的激活需要从没有活性的全长(85 000)被剪切成具有活性亚基。本实验中通过检测发现，ATRA及联合组作用于肿瘤细胞后caspase-3全长表达量明显下降，说明了caspase-3功能亚基的增多，证实了ATRA及联合组通过诱导TCA8113细胞的凋亡是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。

本实验说明ATRA能调节人头颈鳞癌TCA8113细胞周期，并发挥诱导细胞凋亡的作用，与顺铂联合用药后可协同发挥诱导人头颈鳞癌TCA8113细胞的凋亡。这为今后肿瘤化疗药物的联合应用提供里理论依据。

[1]Xavier SD,Bussoloti Filho I,Lancellotti CL.Prevalence of histological finding of human papillomavirus (HPV) in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma biopsies: preliminary study[J].Rev Bras Otorrinolaringol,2005,71(4):510-514.

[2]Collins RJ.Apoptosis in colorectal tumor cells:induction by the short chain fatty acids butyrate.propionate ang acetate ang the bile salt deoxycholate[J].Int J Cancer，1999，60(3):400-402.

[3]侯静，李明峰.全反式维甲酸在恶性肿瘤细胞治疗中的作用研究进展[J].中国药物应用与监测，2007，4(6)：16-18.

[4]Hartwell LH,Ksatan MB.Cell cycle control and cancer [J].Science,1994,266(5192):1821-1828.

[5]刘勇，贾士铨，张一帆，等.全反式维甲酸诱导再分化治疗甲状腺癌的临床研究[J].肿瘤防治研究，2006，33(9):675-683.

[6]Clerici C,Castellani D,Russo G,et al.Treatment with all-trans retinoic acid plus tamoxifen and vitamin E in advanced hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Res,2004,24(2C):1255-1260.

[7]Bartolini G，Ammar K，Mantovani B，et al.Retinoids and cancer:antitumor effect of ATRA and of a new derivative of retinoic acid,IIF on colon carcinoma cell lines CaCo 2 and HT 29[J].Anticancer Res，2004，24(3a):1779-1783.

[8]路太英，樊青霞，王留兴，等.全反式维甲酸诱导食管癌细胞凋亡的实验研究[J].中华肿瘤杂志，2007，29(11)：822-825.

[9]杨平，曹杰，王辉，等.奥沙利铂诱导结肠癌细胞株SW480凋亡过程中caspase-8的活化[J]．广东医学,2007，3(4)：345-348.

[10]邵应举,郑玉玲,樊青霞等.全反式维甲酸与奥沙利铂在诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡中的协同作用[J].西安交通大学学报(医学版),2010,31(4) ：454-458.

Effect of All-trans Retinoic Acid Compared with Cisplatin in Inducing Apoptosis of TCA8113 Cell Lines

Sun Qiang1,2,Qiu Feng1,Zhao Junfang1,Fang Zheng1,Li Xinming1,Sun Minglei1

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;2.InstituteofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

国家自然科学基金资助项目(编号：81402231)；河南省科技厅基础研究和前沿技术研究项目(编号：142300410315)；郑州市口腔颌面外科院士工作站资助项目(编号：152PYSGZ040)；郑州大学第一附属医院院内青年基金项目

孙强(1985-)，男，博士，主治医师，主要从事口腔颌面外科基础与临床工作。E-mail：85244275@qq.com

孙明磊(1973-)，男，博士，主任医师，主要从事口腔颌面外科基础与临床工作。E-mail：sunmlsuccess@sina.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.002

R739.8；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0281-03

2016-07-23)