miR-206抑制SDF-1/CXCR4信号活化诱导的乳腺癌细胞迁移和增殖

葛　新，曹　章，吕鹏威，李靖若，谷元廷

(郑州大学第一附属医院乳腺外科，河南 郑州 450052)



miR-206抑制SDF-1/CXCR4信号活化诱导的乳腺癌细胞迁移和增殖

葛新，曹章，吕鹏威，李靖若，谷元廷

(郑州大学第一附属医院乳腺外科，河南 郑州 450052)

目的研究miR-206在乳腺癌细胞中的作用及其机制。方法MDA-MB-231细胞分别转染miRNA-NC和miR-206 mimic后，荧光显微镜观察转染效率。同时，细胞添加不同剂量(20 ng·mL-1和40 ng·mL-1)基质细胞衍生因子1(SDF-1)处理，利用Transwell法检测细胞迁移，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，qRT-PCR法检测细胞中CXC趋化因子受体4(CXCR4)mRNA表达水平，Western blot检测细胞中CXCR4蛋白表达水平。结果miRNA-NC组和miR-206 mimic组细胞转染效率分别为(83.4±6.3)%和(87.6±8.3)%。与对照组比较，SDF-1显著促进细胞迁移和增殖(P<0.05)。miR-206 mimic转染明显抑制细胞迁移和增殖(P<0.05)。SDF-1处理促进细胞中CXCR4 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。miR-206 mimic转染则抑制CXCR4蛋白表达水平(P<0.05)，但不影响CXCR4 mRNA表达(P>0.05)。结论miR-206通过抑制CXCR4表达拮抗SDF-1诱导乳腺癌细胞迁移和增殖作用。

miR-206；乳腺癌；基质细胞衍生因子-1；CXC趋化因子受体4；迁移；增殖

[Abstract]ObjectiveTo explore the role of miR-206 in the breast cancer cells as well as its mechanism.MethodsFollowing the transfection of miRNA-NC and miR-206 mimic into MDA-MB-231 cells,the transfection efficiency was observed with a fluorescent microscope.Meanwhile,these cells were conditioned with different doses(20 ng·mL-1and 40 ng·mL-1) of stromal-derived factor-1(SDF-1).Cell migration was evaluated by Transwell assay.Cell proliferation was determined by MTT assay.The mRNA expression of CXC chemokine receptor 4(CXCR4) was analyzed by qRT-PCR method.Protein expression of CXCR4 was analyzed by Western blot.ResultsThe transfection efficiency of the miRNA-NC group and the miR-206 mimic group was (83.4±6.3)% and (87.6±8.3)%.Compared with the control group,SDF-1 significantly promoted cancer cells migration and proliferation(P<0.05).Transfection of miR-206 mimic markedly inhibited cancer cells migration and proliferation(P<0.05).SDF-1 conditioning enhanced the mRNA and protein expression of CXCR4 in cancer cells(P<0.05).Transfection of miR-206 mimic constrained CXCR4 protein expression(P<0.05),but did not influence its mRNA expression(P>0.05).ConclusionmiR-206 counteracted the role of SDF-1 in inducing breast cancer cell migration and proliferation through regression of CXCR4 expression.

[Key words]miR-206; breast cancer; stromal-derived factor-1; CXC chemokine receptor 4; migration; proliferation

微小RNA(microRNAs，miRs)是一种进化上保守的、长度约为22个核苷酸的非编码RNA，能够通过序列互补的方式在转录后水平上调控基因的表达[1]。miR-206在多种恶性肿瘤中具有重要的肿瘤抑制作用，包括胃癌[2]、结直肠癌[3]和乳腺癌[4]等。miR-206能够直接靶向抑制肌动蛋白结合蛋白基因的表达、重塑微丝形态、抑制三阴性乳腺癌细胞迁移[5]。我们前期研究[6]也发现miR-206可以直接靶向抑制PFKFB3分子，影响乳腺癌细胞糖酵解过程以及细胞增殖和迁移。基质细胞衍生因子(stromal-derived factor-1，SDF-1)，也称为CXC趋化因子配体12，其跨膜信号由一个G蛋白偶联受体CXC趋化因子受体4(CXC chemokine factor receptor 4，CXCR4)介导[7]，能激活细胞内多个信号通路，进而调控细胞内钙通量、趋化、转录以及细胞存活[8]。国内有研究[9]发现三阴性乳腺癌组织中SDF-1和CXCR4的表达是患者预后的重要生物学指标。本研究拟通过研究miR-206对SDF-1作用下乳腺癌细胞行为的影响，旨在探索miR-206在乳腺癌临床治疗中的作用，为乳腺癌的生物治疗提供实验证据。

1　材料与方法

1.1实验材料MDA-MB-231细胞购自于美国模式培养物保藏所；胎牛血清、DMEM培养基、Trizol试剂盒、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜、硝酸纤维素膜购自大连宝生物公司；重组人SDF-1购自上海沪震生物科技有限公司；miRNA-NC和miR-206 mimic购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine2000、DNA Engine OpticonTM2荧光检测系统和DyNAmo SYBR Green qPCR 试剂盒购自美国Invitrogen公司；抗CXCR4单克隆抗体和酶标羊抗鼠二抗购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与分组处理将MDA-MB-231细胞孵育于体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃恒温、体积分数5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。将细胞随机分为对照组、SDF-1A组、SDF-1B组、miRNA-NC组、miR-206 mimic组。SDF-1A组和SDF-1B组细胞分别用20 ng·mL-1和40 ng·mL-1SDF-1处理12 h，对照组细胞用等体积的PBS处理，miRNA-NC组和miR-206 mimic组细胞分别转染miRNA-NC和miR-206 mimic 24 h后，添加40 ng·mL-1SDF-1处理12 h。

1.2.2miR-206 mimic转染miRNA-NC和miR-206 mimic干粉离心后配制成终浓度为20 mol·L-1的工作液铺板，24 h内进行转染，按照Lipofectamine2000说明书进行转染，转染6 h后换液，继续培养24 h后荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.3Transwell法检测细胞迁移MDA-MB-231细胞转染48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，细胞计数3×105，转移至Transwell上层小室中，每孔铺200 μL细胞，加入200 μL无血清培养基。下层板孔中加入600 μL完全培养基，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养24 h，随后取出小室用体积分数90%乙醇固定，质量分数0.1%结晶紫溶液染色，置于显微镜下观察并拍照，随机选取4个低倍视野(×100)进行细胞计数，并计算平均值。

1.2.4MTT法检测细胞增殖收集对数生长期细胞，按每孔3×104个接种于96孔培养板。细胞达到80%融合时用于MTT实验。MTT实验检测分别在细胞培养24 h、48 h、72 h、96 h 后进行。按实验分组情况，每孔加入 20 μL MTT(5 mg·mL-1)后培养4 h。去掉上清，按照每孔150 μL加入二甲基亚砜。混匀后用酶标仪测定(测量波长为570 nm)。实验重复3次，取平均数作为实验结果。

1.2.5qRT-PCR检测利用Trizol试剂盒提取培养细胞系总RNA，按照步骤反转录合成cDNA。查找Genbank序列设计并合成CXCR4基因引物序列，上游引物：5’-GGT GGT CTA TGT TGG CGT CT，下游引物： 5’-TGG AGT GTG ACA GCT TGG AG-3’。采用DNA Engine OpticonTM2荧光检测系统和DyNAmo SYBR Green qPCR 试剂盒进行基因表达的测定。反应体系为25 μL，其中12.5 μL DyNAmo SYBR Green qPCR mix，0.5 μL 20 pmoL引物，2 μL cDNA模板(<10 ng·mL-1)。反应条件为：94 ℃预变性10 min，94 ℃ DNA变性20 s，引物在54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环，72 ℃后延伸10 min。熔解曲线的制作条件为65～95 ℃，每0.2 ℃停留1 s。目的基因和 β-actin基因的拷贝数分别根据产生的Ct值从各自的标准曲线获得。取3次重复的平均值，靶基因的相对表达量的计算由目的基因的拷贝数除以β-actin的拷贝数。

2　结果

2.1miR-206转染MDA-MB-231细胞情况miR-206 mimic及miRNA-NC转染MDA-MB-231细胞后，荧光显微镜下可观察到细胞内的荧光信号(图1)，则视为转染成功。通过细胞计数可得，miRNA-NC组和miR-206 mimic组转染效率分别为(63.4±6.3)%和(67.6±8.3)%。

图1　荧光显微镜观察miRNA-NC和

2.2miR-206拮抗SDF-1诱导的乳腺癌细胞迁移情况与对照组细胞比较，20 ng·mL-1SDF-1(SDF-1A组)和40 ng·mL-1SDF-1(SDF-1B组)处理明显促进肿瘤细胞体外迁移(P<0.05)；与SDF-1A组及SDF-1B组比较，miR-206 mimic+SDF-1处理显著降低细胞迁移(P<0.05)，而miRNA-NC+SDF-1则无影响(P>0.05)。见图2、3。

图2　Transwell法检测MDA-MB-231细胞的体外迁移

图3　MDA-MB-231细胞体外迁移定量分析

与对照组比较，1)P<0.05；与SDF-1A组比较，2)P<0.05；与miRNA-NC比较，3)P<0.05

2.3miR-206拮抗SDF-1诱导的乳腺癌细胞增殖情况与对照组细胞比较，SDF-1A组和SDF-1B组细胞增殖速率显著升高(P<0.05)；miR-206 mimic转染后，细胞增殖速率降低(P<0.05)，而转染miRNA-NC则不能改变细胞增殖速率(P>0.05)。见图4。

图4　MTT法检测MDA-MB-231细胞增殖

与对照组比较，1)P<0.05；与SDF-1A组比较，2)P<0.05；与miRNA-NC比较，3)P<0.05

2.4miR-206对乳腺癌细胞CXCR4 mRNA表达的影响qRT-PCR法检测各组细胞CXCR4 mRNA的表达，结果显示，SDF-1A组和SDF-1B组细胞CXCR4 mRNA明显高于未经处理的对照组细胞(P<0.05)；转染miRNA-NC和miR-206 mimic对CXCR4 mRNA的表达无显著影响(P>0.05)。见图5。

2.5miR-206对乳腺癌细胞中CXCR4蛋白表达的影响Western blot检测细胞CXCR4蛋白的表达，结果显示，对照组细胞比较，SDF-1处理显著促进MDA-MB-231细胞中CXCR4蛋白的表达(P<0.05)；但是，转染miR-206 mimic显著抑制细胞中CXCR4蛋白的表达(P<0.05)，转染miRNA-NC则不能对CXCR4的表达产生显著影响(P>0.05)。见图6、7。

图5　qRT-PCR技术检测

与对照组比较，1)P<0.05；与SDF-1A组比较，2)P<0.05

图6　Western blot检测

图7　CXCR4蛋白条带定量分析

与对照组比较，1)P<0.05；与SDF-1A组比较，2)P<0.05；与miRNA-NC比较，3)P<0.05

3　讨论

研究[10]显示miRNA调控细胞内基因的表达，既可以作为乳腺癌促癌基因也可以作为抑癌基因。促癌miRNA在乳腺癌细胞中表达上调，并能够抑制下游许多与肿瘤抑制相关的基因的表达，例如原肌球蛋白1、程序性细胞凋亡因子4、同源性磷酸酶-张力蛋白、和金属蛋白酶组织抑制因子等[10]。相反，肿瘤抑制miRNA则可以靶向抑制促癌基因，当它们功能缺失时，则可能导致细胞癌变[10]。miR-206是一种抑癌基因，其表达下调与多种恶性肿瘤的发生相关，其中包括乳腺癌[11]、胃癌[12]等。因此，研究miR-206在乳腺癌细胞中的作用机制具有重要的临床意义。本研究利用miRNA-NC和miR-206 mimic体外转染MDA-MB-231乳腺癌细胞，荧光显微镜下观察，转染效率可分别达(63.4±6.3)%和(67.6±8.3)%，因此可用于下一步研究，探索miR-206对肿瘤细胞的表达调控。

趋化因子家族是结构上相关、具有4个保守半胱氨酸位点的趋化性细胞因子，能够与7次跨膜的G蛋白偶联受体结合[13]。SDF-1是最先发现的与发育相关的趋化因子，具有调控造血作用、心脏发生、血管形成和神经形成的功能[13]。近年来，研究[14]发现SDF-1在肿瘤疾病进展中具有重要作用，利用SDF-1处理小鼠乳腺癌细胞可显著促进细胞增殖和迁移。本研究首先利用2个不同剂量的SDF-1处理MDA-MB-231细胞，Transwell实验结果发现这2个剂量的SDF-1均可促进细胞迁移，且具有剂量依赖性，验证了趋化因子SDF-1对乳腺癌细胞的作用。然而，当细胞转染miR-206 mimic时，细胞迁移受到明显抑制，而转染miRNA-NC则不影响细胞迁移，说明了miR-206可以拮抗SDF-1诱导的迁移作用。本研究同时检测了SDF-1对细胞增殖的影响。MTT实验结果表明，2个剂量的SDF-1均可显著促进细胞增殖，其中高剂量组作用最明显。与转染miRNA-NC比较，转染miR-206 mimic后，细胞增殖速率显著降低，说明了miR-206具有拮抗SDF-1诱导癌细胞增殖的作用。

CXCR4是趋化因子SDF-1的经典受体。SDF-1与CXCR4相互作用可活化下游多条信号转导通路以及效应因子，从而介导细胞存活、增殖、趋化、迁移和粘附等细胞行为[15]。詹升华等[16]研究发现CXCR4表达于乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中，SDF-1可有效促进乳腺癌细胞的体外增殖和迁移。通过查阅TargetScan数据库发现CXCR4是miR-206的潜在靶分子之一。因此本研究猜测miR-206可能通过直接调控CXCR4的表达来影响其配体SDF-1的作用。利用qRT-PCR法检测乳腺癌细胞中mRNA的表达，结果发现SDF-1处理可以显著促进细胞中CXCR4 mRNA的表达；转染miRNA-NC以及miR-206 mimic后，细胞中CXCR4 mRNA表达水平没有明显变化，说明miR-206不影响CXCR4的转录水平。随后研究进一步利用Western blot法检测细胞中CXCR4蛋白的表达。与mRNA水平类似，SDF-1可以提高乳腺癌细胞中CXCR4蛋白水平；然而转染miR-206 mimic后，CXCR4蛋白的表达水平受到显著抑制，转染miRNA-NC则无此作用，说明了miR-206对CXCR4表达的调控发生在转录后水平。

综上所述，本研究发现miR-206可通过抑制乳腺癌细胞中CXCR4的表达、拮抗SDF-1诱导的细胞增殖和迁移作用。本研究局限于体外实验，在之后研究中需要更多的体内实验和临床数据证明miR-206通过CXCR4发挥肿瘤抑制作用，从而为乳腺癌的靶向治疗提供实验证据。

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MiR-206 Suppresses Breast Cancer Cell Migration and Proliferation Induced by SDF-1/CXCR4 Signaling

Ge Xin,Cao Zhang,Lv Pengwei,Li Jingruo,Gu Yuanting

(DepartmentofBreastSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

葛新(1981-)，女，博士，主治医师，主要从事乳腺疾病基础和临床研究。E-mail：gexin1981@126.com

谷元廷(1965-)，男，博士，主任医师，主要从事乳腺疾病基础和临床研究。E-mail：zzyuantinggu@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.04.005

R737.9；R730.23

A

1673-5412(2016)04-0294-05

2016-07-06)