高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法在血清同型半胱氨酸含量检测中的应用*

杨元好肖静蒋艺勤吴永国唐娟

高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法在血清同型半胱氨酸含量检测中的应用*

杨元好①肖静①蒋艺勤①吴永国①唐娟①

目的：比较高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法对血清同型半胱氨酸含量测定效果。方法：选取2013年12月-2015年9月于本院健康体检的体检者120例作为研究对象，将其分为高效液相色谱法组和L-蛋氨酸γ-裂解酶法组，每组60例。比较两组变异系数、回收率及准确度。结果：两组不同浓度批内和日间变异系数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；两组不同浓度回收率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；两组检测同型半胱氨酸含量比较，差异无统计学意义（P>0.05），L-蛋氨酸γ-裂解酶法组检测准确率为99.24%，高于高效液相色谱法组的89.63%，比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在同型半胱氨酸含量的测定中，两组检测稳定性无明显差异，相对高效液相色谱法而言，L-蛋氨酸γ-裂解酶法检测准确率较高。在临床检验中，可以根据检测工作需求选择合适的检测方法。

高效液相色谱法； L-蛋氨酸γ-裂解酶法； 同型半胱氨酸

同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，其在血液中的含量过高会产生同型半胱氨酸症，同时同型半胱氨酸的浓度增加，与心脑血管疾病的发病有着密切的关系，可以说同型半胱氨酸浓度已经成为脑卒中、冠心病等心脑血管疾病发病的危险因素[1]。所以在临床治疗中，对同型半胱氨酸进行检测，可以有效的对患者病情进行判断，进而为患者实施有效的治疗，降低死亡率的发生[2]。当前在同型半胱氨酸的检测中，不同的检测方法，检测的结果存在着差异性，影响着检测结果的准确性[3]。L-蛋氨酸γ-裂解酶法，在同型半胱氨酸的检测中有较高的检测效果，高效液相色谱法也是同型半胱氨酸检测中使用的检测方法。为了研究两种检测方法，在同型半胱氨酸的检测中的测定准确性，本文针对高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法对血清中同型半胱氨酸含量的测定效果进行分析研究，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2013年12月-2015年9月于本院健康体检的体检者120例作为研究对象，将其平均分为高效液相色谱法组和L-蛋氨酸γ-裂解酶法组，每组60例。高效液相色谱法组中男36例，女24例；年龄45～76岁，平均（57.4±2.3）岁。L-蛋氨酸γ-裂解酶法组男35例，女25例；年龄44～78岁，平均（57.5±2.4）岁。两组性别和年龄等一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 首先，分别抽取两组研究对象空腹静脉血，经抗凝分离处理后，低温保存血清待检；其次，提取其中的同型半胱氨酸，形成不同浓度的同型半胱氨酸标本；最后，将其稀释成不同的浓度，分别使用高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法对血清中同型半胱氨酸含量进行测定。同型半胱氨酸的浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L。高效液相色谱法检测仪器包括AU2700全自动生化分析仪器、510液相色谱仪、HCU色谱分析柱等，对测定样品进行预处理，然后加入相关试剂进行检测。L-蛋氨酸γ-裂解酶法：在3（γ-羧乙基）膦氯化氢作用下，血清中胱氨酸、蛋白结合型和混合型同型半胱氨酸转化成游离型的同型半胱氨酸，加入的L-蛋氨酸γ-裂解酶在PLP辅助下，将游离的同型半胱氨酸分解出α-丁酮酸、氨和硫化氢。硫化氢和荧光化合物N，N-双甲基- p -亚苯二胺双盐酸（DMPD·2HCl）在Fe3+和酸性条件下反应形成最高吸光率在670 nm处的蓝色产物亚甲蓝，在全自动生化分析仪上通过定量测定亚甲蓝在670 nm处的吸光率来计算血清总同型半胱氨酸的含量。

1.3评价指标 （1）精度检验：取待检10.0 μmol/L为低浓度、40.0 μmol/L为高浓度的同型半胱氨酸标准液各一份，进行上、下午的双测定，并连续测定20 d；（2）回收实验：将10.0、40.0 μmol/L同型半胱氨酸采用高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法测定回收率；（3）含量检测：对各个浓度的同型半胱氨酸的含量进行测定，加入相应的试剂进行检测，确定检测的准确度，所有检测结果均取平均值。

1.4统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两种检测方法变异系数比较 两组不同浓度批内和日间变异系数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1　两种检测方法变异系数比较 %

2.2两种检测方法回收率比较 两组不同浓度回收率比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2　两种检测方法回收率比较 %

2.3两种检测方法准确率比较 L-蛋氨酸γ-裂解酶法组检测准确率为99.24%，高于高效液相色谱法组的89.63%，比较差异有统计学意义（x2=3.564，P=0.015）。

2.4两种检测方法不同浓度同型半胱氨酸含量的测定结果比较 两组检测同型半胱氨酸含量比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

3　讨论

随着社会的发展和人们生活水平的提升，各种心脑血管疾病的发病率不断提高，严重威胁着人们的身体健康和生命安全。当前在临床治疗中，发病率较高的心脑血管疾病有高血压、冠心病、脑卒中、脑梗死等[4]。造成心脑血管疾病发病的因素有很多，随着临床医学的研究，除了可以控制的危险因素，如饮酒、吸烟、糖代谢异常等因素外，还有一些通过药物治疗可以改善的危险因素。同型半胱氨酸是蛋氨酸代谢过程中的一个中间产物，其与各种心脑血管疾病的发病有着密切的关系[5-8]。同型半胱氨酸浓度增加，会产生同型半胱氨酸血症，而重度同型半胱氨酸血症会诱发动脉粥样硬化、静脉栓塞等，为此在心血管疾病发病因素的研究中，人们开始关注同型半胱氨酸。在临床治疗中，同型半胱氨酸在心脑血管疾病的诊断中起着关键性作用，同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，属于人体内的一种内源性物质，在大多数的情况下以与白蛋白结合物的形式出现[9-12]。同型半胱氨酸有较强的亲水性和极性，其对紫外线的吸收较弱，可以通过转硫通路而产生半胱氨酸[13]。在人体中同型半胱氨酸的代谢工作受阻，同型半胱氨酸会在患者的体内产生积聚，并进入血液循环中，影响患者血液的正常循环，进而造成各种心脑血管疾病的发展[14-16]。

表3　两种检测方法不同浓度同型半胱氨酸含量的测定结果比较（±s） μ mol/L

表3　两种检测方法不同浓度同型半胱氨酸含量的测定结果比较（±s） μ mol/L

组别　1.0 μmol/L　2.0 μmol/L　5.0 μmol/L　10.0 μmol/L　20.0 μmol/L　40.0 μmol/L高效液相色谱法组（n=60）　0.87±0.06　1.88±0.11　4.79±0.16　9.84±0.15　19.43±0.23　38.98±0.16 L-蛋氨酸γ-裂解酶法组（n=60）　0.89±0.07　1.92±0.05　4.82±0.13　9.77±0.21　19.67±0.26　38.97±0.15 t值　1.6803　1.5642　1.1272　1.1011　1.5783　0.3532 P值　0.0955　0.1674　0.2619　0.5347　0.1534　0.7246

在对同型半胱氨酸进行检测的过程中，不同的检测方法有不同的检测结果和检测准确率，高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法是当前同型半胱氨酸含量检测中常用的两种检测方法，这两种检测方法的检测结果有一定的差异性，但是其检测结果的准确率均相对较高[17-20]。为此本文针对高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法对血清中同型半胱氨酸含量的测定效果进行了对比研究。本研究结果显示：高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法在同型半胱氨酸含量的测定中，变异系数、回收率、同型半胱氨酸的含量比较差异均无统计学统计学意义（P>0.05），说明高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法的检测准确性均较好，但是L-蛋氨酸γ-裂解酶法测定同型半胱氨酸含量的检测准确率相对较高（P<0.05），因此，在实际检测应用中可根据检测需求和相关条件合理选择检测方法。

综上所述，高效液相色谱法与L-蛋氨酸γ-裂解酶法的在血清同型半胱氨酸含量测定中具有一定的可行性，且测定的操作相对简单，但是L-蛋氨酸γ-裂解酶法的测定结果准确性较高效液相色谱法高，在实际的测定中可以根据实际需求，选择合适的测定方法进行测定，为患者的病情诊断提供有效的临床诊断依据。

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Application of High Performance Liquid Chromatography（HPLC） and L-methionine γ Cracking Enzymatic Methods on the Detection of Serum Homocysteine Levels

Y ANG Y uan-hao，XIAO J ing，J IANG Yi-qin，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（24）：050-053

Objective：To compare the effect of high performance liquid chromatography（HPLC） and L-methionine γ cracking enzymatic methods on the detection of serum homocysteine levels.Method：From December 2013 to September 2015，120 cases of physical examination in our hospital were selected as the research objects，they were divided into the HPLC group and L-methionine γ cracking enzymatic group，each group had 60 cases.The variation coefficient，recovery rate and accuracy of two groups were compared. Result：There were no significant differences of two groups in the different concentration of the intra and inter day variation coefficient（P>0.05）.There was no significant difference in the recovery rate of two groups（P>0.05）. There was no significant difference of two groups in the detection of homocysteine levels（P>0.05），the detection accuracy of L-methionine γ cracking enzymatic group was 99.24%，higher than 89.63% of the HPLC group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：In the detection of homocysteine levels，there was no obvious difference of two groups in detection stability，the detection accuracy of L-methionine γ cracking enzymatic method is higher in the relative high performance liquid chromatography.In the clinical test，according to the detection of the need to choose the appropriate detection method.

High performance liquid chromatography； L-methionine γ cracking enzymatic method； Homocysteine

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.24.013

2016-05-14） （本文编辑：李颖）

2009年深圳市科技计划项目（200903191）

①广东省深圳市宝安区松岗人民医院 广东 深圳 518105

杨元好

First-author’s address：Baoan District Songgang People’s Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518105，China