运用人多潜能干细胞研究SOX10在先天性巨结肠症中的发病机制*

陈炜马婉琳谢小红伍绍国

运用人多潜能干细胞研究SOX10在先天性巨结肠症中的发病机制*

陈炜①马婉琳①谢小红①伍绍国①

目的：运用人多潜能干细胞研究SOX10在先天性巨结肠症（HD）中的发病机制。方法：选择2014年1月-2015年12月，17例HD患儿作为病例组；与性别、年龄配对的17例非巨结肠手术患儿作为对照组，收集术中切除肠段，提取RNA并检测SOX10表达水平。将人多潜能干细胞定向分化为神经崤细胞，构建SOX10 shRNA慢病毒质粒，转入SOX10 shRNA慢病毒质粒，检测SOX10基因表达下调后，导入SOX10，再次检测SOX10基因表达，与对照组相比上调后，观察神经崤细胞迁移能力。结果：病例组标本检测，痉挛段、移行段和扩张段SOX10/β-actni灰度值分别为（0.9254±0.2758）、（1.3082±0.0546）、（1.3147±0.0613），对照组为（1.3178±0.0715），痉挛段与正常肠段SOX10/β-actni灰度值比较差异有统计学意义（P<0.05）。移行段、扩张段与痉挛段SOX10/β-actni灰度值比较，差异均有统计学意义（P<0.05），与正常肠段比较差异均无统计学意义（P>0.05）。25μL SOX10 shRNA慢病毒质粒下调SOX10表达下调率为63.7%。加入促迁移因子laminin前，荧光显微镜下随机视野计数结果显示，神经嵴干细胞数量数为28%。加入后神经嵴干细胞数量数为65%，差异有统计学意义（x2=12.829，P<0.05）。结论：SOX10在正常结肠组织中高表达，但在HD结肠痉挛段呈低表达，同时SOX10表达失调参与HD的发生和发展，运用人多潜能干细胞试验证实下调SOX10可导致神经崤细胞迁移障碍，而促迁移因子laminin可恢复其迁移能力。

人多潜能干细胞； SOX10； 先天性巨结肠症； 发病机制

先天性巨结肠症（Hirschsprung’s disease，HD）又称先天性肠神经节细胞缺乏症[1]，临床表现为小儿直肠或结肠远端痉挛，出现排便障碍、无法排便，引起肠梗阻，严重的可致患儿死亡[2-3]。是一种常见的出生缺陷，发病率为0.02%～0.05%。到目前为止，HD的发病机制尚未完全阐明。有研究对患儿手术切除的发病肠段进行分析发现，神经节较少甚至缺失，使该肠段自主运动能力低下或缺失，从而发生肠畸形和痉挛，因此何种机制出现肠神经节减少或缺失是先天性巨结肠症发病机制的关键[4]。近年来有研究证实，HD患者存在SOX10基因突变，认为SOX10基因是参与肠神经系统发育的重要基因[5]。本研究通过HD结肠对正常结肠组织SOX10mRNA相对表达量的检测，并运用人多潜能干细胞研究SOX10在先天性巨结肠症中的发病机制，旨在进一步阐明HD的病因，为治疗提供参考，现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 病例组：2014年1月-2015年12月，17例HD患儿手术标本，男13例，女4例，年龄3 d～13个月，平均（4.7±1.4）个月，均为散发性，其中短段型10例，常见型6例，长段型1例，所有病例均无HD家族史，也未合并其他先天性畸形；对照组：以性别、年龄配对选取17例非巨结肠手术患儿正常结肠组织，男13例，女4例，年龄3 d～13个月，平均（4.5±1.2）个月，其中肠套叠肠坏死回结肠吻合术9例，肛门闭锁行结肠造屡术4例，直肠闭锁行结肠造屡术4例。两组患儿年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2纳入与排除标准 试验经本院医学伦理委员分批准，患儿家属知情同意愿意接受研究并签署知情同意书。入选标准：病例组患儿术后病理证实均为HD，对照组患儿术后病理证实均非HD；排除标准：其他先天性消化道畸形史患儿，家族性顽同便秘患儿。

1.3方法

1.3.1主要设备与试剂 电泳仪型琼脂糖凝胶水平电泳装置；德国Biometra公司PCR仪；PCR合成仪；SANYO -86 ℃超低温冰箱；TGL-16G型台式低速离心机；DK-SD电热恒温水槽水浴锅；ZF型之外透射反射分析仪；Gene GeniuS成像分析系统；SK1311 Trizol RNA抽提试剂盒（美国GIBCO公司）；dNTP mix（美国Genview公司）；random primers（上海Sangon技术服务有限公司）；First-strand buffer（美国Gibeo公司）；Rnasin（美国MBI公司）；β-actin引物（上海Sangon技术服务有限公司）；DNA Marker DL2000bP（郑州宝信生物科技有限公司）。

1.3.2标本处理 术中立即取病变肠管，选取全层肠壁组织，无菌生理盐水冲洗标本后，弃去黏膜，无菌生理盐水再次冲洗标本组织后，置DEPC水消毒过的Ep管中，不用任何试剂固定，立即送-86 ℃恒温冰箱中保存，并于2周内做RT-PCR分析，以减少RNA降解；病例组所有标本均经术中诊断、术前X线检查和术后常规组织学检查。

1.3.3SOX10检测方法 严格按试剂盒说明操作，提高组织总RNA，分别鉴定完整性和纯度，计算RNA的 量。RNA量（pg/mL）=OD260×稀 释倍数×40/2000，再按1OD260=40 μg RNA计算RNA产率。逆转录合成cDNA，PCR扩增，最后进行PCR产物电泳分析，分别将5 μLβ-actni PCR、LSOX10PCR产物和1～2 μL上样缓冲液混匀后注入加样孔内，电泳约20 min，分析观察电泳结果并进行灰度扫描，应用Gene GeniuS成像分析系统作半定量分析，以SOX10/β-actni灰度值比表示SOX10mRNA的相对表达量。

1.3.4SOX10对神经崤细胞迁移的调节作用 将人多潜能干细胞定向分化为神经崤细胞，检测p75和AP2表达，确定定向诱导有效后，制备25 μL SOX10 shRNA慢病毒质粒，转入SOX10 shRNA慢病毒质，检测SOX10基因表达下调后，p75/Ret免疫荧光染色标记，计数神经嵴干细胞数量。加入促迁移因子laminin后，再次计数神经嵴干细胞数量。

1.4观察指标 比较病例组痉挛段、移行段、扩张段和对照组SOX10mRNA的相对表达量。同时观察25 μL SOX10 shRNA慢病毒质致SOX10基因表达下调率；加入促迁移因子laminin后神经嵴干细胞数量。

1.5统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用x2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1SOX10mRNA相对表达量比较 病例组痉挛段与正常肠段SOX10/β-actni灰度值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。病例组移行段、扩张段与痉挛段SOX10/β-actni灰度值比较，差异均有统计学意义（P<0.05），与正常肠段比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1　两组SOX10mRNA相对表达量比较（±s）

表1　两组SOX10mRNA相对表达量比较（±s）

*与痉挛段比较，P<0.05

SOX10/β-actni灰度值痉挛段　移行段　扩张段　正常肠段病例组（n=17）　0.9254±0.2758　1.3082±0.0546*1.3147±0.0613*-对照组（n=17）　-　-　-　1.3178±0.0715 t值　16.204　1.207　0.568　-P值　0.000　0.093　0.647　-组别

2.2SOX10 shRNA慢病毒质对SOX10下调率的影响 25Μl SOX10 shRNA慢病毒质粒下调SOX10表达下调率为63.7%。

2.3加入促迁移因子laminin前后神经嵴干细胞数量观察 加入促迁移因子laminin前，荧光显微镜下随机视野计数结果显示，神经嵴干细胞数量数为28%。加入后神经嵴干细胞数量数为65%，差异有统计学意义（x2=12.829，P<0.05）。

3　讨论

肠神经系统（enteric nervous system，ENS）由神经节细胞、致密的神经纤维和特殊的胶质细胞组成，神经纤维连接各神经节细胞，构成完整的调节系统[6-10]，具有独立控制胃肠蠕动，调节消化道吸收和分泌的重要功能。ENS源于神经崤细胞巢，在胚胎发育早期，神经管闭合后，其双侧细胞带发育成神经崤，当神经崤发育到一定阶段，从神经管分离出来后，神经崤细胞开始向下迁移，部分细胞逐渐下降至咽囊段和躯干部，继而迁移至各大脏器，最终定位于胚胎某一部位，形成神经节细胞。因此推测先天性巨结肠症（Hirschsprung’s disease，HD）的发病原因可能是神经崤细胞在迁移和定位中受肠管微环境诸多因素的影响，出现迁移障碍，致神经崤无法下降至大肠末端而致发病肠段神经节细胞缺失，发生HD[11-13]。

DomSOX10是杂合子动物中产生致死性ENS表型的唯一被认识的基因突变。目前多数观察认为HD肠神经系统神经节细胞缺失的原因是环境和遗传因素共同作用的结果[14]。近年来随着分子生物学技术的发展，己明确HD肠神经系统神经节细胞缺失与多种基因密切相关[15]。SOX10属SOX家族，位于染色体22q13，参与细胞定向分化，干性维持和组织形成等，是一族进化过程中高度保守的基因，在神经嵴、oligodendrocyte细胞、Schwann细胞和外周神经系统的形成、成熟和终末分化中均发挥了重要作用，而SOX10突变可导致肠神经系统发育异常。同时国外研究证实，SOX10的未成熟终止突变可引起神经崤细胞衍生物表达缺失，他们认为SOX10可能是不与其他易患基因相关的侯选突变位点[16-17]。动物实验研究已证实，缺乏SOX10小鼠肠神经系统发育停顿，表明小鼠SOX10基因中单个碱基的插入是突变体巨结肠表型的主要原因，并推测可能是突变的神经崤细胞在其移行中早期过量死亡所致[18-19]。目前已证实人类严重的SOX10突变可导致HD、瓦尔敦堡综合征个体及耳聋，提示其可能参与了调节突变的神经崤细胞的早期发育和信号途径，使其分化为肠神经节细胞和黑色素细胞[12]。

Sham等[20]检测了sox10在HD结肠和正常结肠中的表达，结果发现，正常结肠中的表达明显高于HD结肠。本研究结果显示，病例组标本痉挛段SOX10/β-actni灰度值为（0.9254±0.2758），明显低于移行段、扩张段和正常肠段，差异均有统计学意义（P<0.05），与Sham等[20]研究相符。说明在HD结肠段SOX10mRNA呈低表达，同时也说明SOX10基因不仅在胚胎时间对肠神经系统产生影响，其在出生后也是维持肠神经系统正常功能所必须的，一旦表达减少，则可能引起肠管痉挛，造成功能障碍。运用人多潜能干细胞，定向分化为神经崤细胞，转入SOX10 shRNA慢病毒质后，SOX10表达率下降达63.7%，加入促迁移因子laminin前后，神经嵴干细胞数量比较差异有统计学意义（P<0.05）。说明SOX10在正常结肠组织中高表达，但在HD结肠痉挛段呈低表达。同时SOX10表达失调参与HD的发生和发展，运用人多潜能干细胞试验证实下调SOX10可导致神经崤细胞迁移障碍，而促迁移因子laminin可恢复其迁移能力。

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Using Human SOX10 Pluripotent Stem Cell Research in the Pathogenesis of Hirschsprung’s Disease

CHEN Wei，MA Wan-lin，XIE Xiao-hong，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（24）：010-013

Objective：To apply SOX10 human pluripotent stem cell research in the pathogenesis of hirschsprung’s disease（HD）.Method：From January 2014 to December 2015，17 cases children with HD as a group.By gender，age，matching of 17 cases of children with hirschsprung surgery as the control group，collection of excision of the intestine， extracting RNA and detecting SOX10 expression level.Human pluripotentstem cells，directional differentiation into neural xiaohan cells， build SOX10 shRNA lentivirus plasmid，into SOX10 shRNA lentivirus plasmid，detect SOX10 gene expression after the downgrade，import SOX10，again to detect SOX10 gene expression，compared with the control group after raising，ability to observe neural xiaohan cell migration.Result：CPT samples，spas m，transitional period and the expansion period of SOX10/beta actni grey value were respectively （0.9254±0.2758），（1.3082±0.0546），（1.3147±0.0613） and the control group was （1.3178±0.0715），convulsion period and normal bowel SOX10/beta actni grey value comparison difference was statistically significant（P<0.05）.Transitional period，expanding period and spasm SOX10/beta actni grey value comparison difference was statistically significant（P<0.05）.There was no statistically significant difference compared with normal bowel（P>0.05）.25 μL SOX10 shRNA lentivirus cut SOX10 expression plasmid cut rate was 63.7%.Before joining migration factors laminin，fluorescence microscope counting random field of vision，according to the results of neural crest stem cell number count was 28%.After joining neural crest stem cell number count was 65%，the difference was statistically significant（x2=12.829，P<0.05）.Conclusion：SOX10 in normal colon tissue increases，but lower expression in HD colon spasms segment，the imbalance in SOX10 expresses the occurrence and development of HD，experiment using human pluripotent stem cells confirmed by SOX10 can cause nerve xiaohan cell migration barriers，and promote migration factor laminin can restore its ability to migrate.

Human pluripotent stem cells； SOX10； Congenital hirschsprung disease；Pathogenesis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.24.003

2016-05-06） （本文编辑：程旭然）

广东省医学科学技术研究基金（WST JJ20140610430105198106043011）

①广州市第十二人民医院 广东 广州 510000

陈炜

First-author’s address：The Twelfth People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510000，China