BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

生秀梅， 王正新



BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

生秀梅， 王正新

目的构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2，并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能。方法通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段，将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，形成pCDH-BTG2，转染PC3细胞检测BTG2的表达；将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒，感染肺癌A549细胞后，通过蛋白免疫印迹法检测 BTG2的表达，细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响。结果pCDH-BTG2重组质粒构建成功，转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达，pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后，显著抑制A549细胞的生长。结论成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2，并发现BTG2抑制A549细胞的生长，为研究BTG2的功能奠定了基础，同时为肺癌的药物研究提供了靶点。

慢病毒属； 基因； 基因表达； 肺肿瘤； 肿瘤细胞，培养的； 重组，遗传

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，每年有近140万的死亡病例，目前治疗仍以手术为主，预后差，生存期短，因此尽快找到新的诊疗方法或研制出新的诊疗试剂显得尤为迫切[1-2]。本室前期工作中发现在肺癌A549细胞中沉默原癌基因p44的表达后，B细胞转位基因(B-cell translocation gene 2, BTG2)的表达显著上调。BTG2是抗细胞增殖TOB/BTG基因家族的成员之一，主要参与细胞分化、发育、凋亡、肿瘤细胞抑制等生理病理过程，被认为是一种新的抑癌基因[3-5]。本研究利用基因重组技术构建携带有BTG2基因的重组慢病毒载体，包装慢病毒颗粒，感染A549细胞，观察BTG2基因在肺癌A549细胞中的表达及其对A549细胞生长的影响，为进一步研究BTG2在肺癌的发生发展及在p44通路中的作用奠定基础。

1　材料和方法

1.1材料 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体系统(美国SBI公司，该病毒包装系统由SBI公司提供)；A549细胞、293T细胞、pRL-CMV及E.coliXL 10-gold感受态细胞由本室保存；LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；人BTG2基因cDNA克隆(HsCD00330081)(美国DNASU质粒储存库)。

1.2方法

1.2.1重组BTG2基因慢病毒载体的构建根据GenBank注册的BTG2序列(BC105949)设计并合成上下游引物BTG2-F和BTG2-R，分别在上下游引物的5′端加接XbaⅠ和NotⅠ酶切位点序列，为增加BTG2的表达，在上游引物中BTG2起始密码子AUG前添加ACC碱基[6-8]，上下游引物分别为：

BTG2-F：GCTCTAGAACCATGAGCCACGGGAAGG

GAAC (下划线为XbaⅠ酶切位点)

BTG2-R：ATAGTTAGCGGCCGCGCTGGAGACTGC

CATCACG(下划线为NotⅠ酶切位点)

以含有BTG2基因的cDNA克隆质粒(pLenti6.2/V5-DEST-BTG2)为模板，以BTG2-F/R为引物，通过PCR技术获取目的基因BTG2。PCR产物经胶回收后和慢病毒载体pCDH-CMV-MCS(FLAG)-EF1-Puro经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶室温连接过夜，将连接产物转化至E.coliXL 10-gold。经双酶切验证后，通过DNA测序分析最终确认，命名为pCDH-BTG2。

1.2.2重组BTG2基因慢病毒载体pCDH-BTG2转染PC3细胞PC3细胞接种于24孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养至细胞密度为50%～80%时，更换为无血清无嘌呤霉素培养基，100 ng pCDH-BTG2或100 ng pCDH与5 ng pRL-CMV经Lipofectamine2000转染试剂共转染PC3细胞，6 h后换新鲜含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，48 h后收集细胞，Western-blot检测BTG2蛋白的表达水平。

1.2.3重组慢病毒(Lenti-BTG2)的包装及浓缩应用LipofectamineTM2000将pCDH-BTG2质粒、包装结构质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G按4∶3∶1的比例混合，共转染对数生长期的293T细胞。转染24 h，更换新鲜培养基8～10 mL，再过48 h，收集细胞上清液(含慢病毒)，用0.45 μm滤膜过滤细胞残片后，密封好置4 ℃保存。如果长时间保存，则分装后冻存于-80 ℃冰箱。

1.2.4重组慢病毒(Lenti-BTG2)感染细胞试验将A549细胞接种于6孔板，以MEM培养液(10%胎牛血清)培养。第2天细胞融合度达到70%～80%时，换上含重组慢病毒颗粒悬液30，50，100，150或200 μL的新鲜培养基1 mL，加入终浓度为8 μg/mL的Polybrene以增加感染效率。同时设立Lenti-pCDH空病毒组。转染16 h后，换普通MEM培养液(10%胎牛血清)培养。感染第3天，吸去培养基，加入5 mL PBS，轻轻振荡漂洗细胞，加入0.3 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，消化5 min，倒置显微镜下观察，待细胞收缩变圆，加3 mL含血清MEM培养液，用吸管轻轻吹打，吸取30 μL悬液于细胞计数板计数，细胞数/mL=(4大格细胞总数/4)×104×3.3，余下部分全部转至100 mm培养皿，补充含血清MEM培养液至10 mL，继续培养3 d，同样方法计数。每组实验重复3次，取平均值。收集剩余细胞进行Western-blot检测。

1.2.5Western-blot法检测BTG2蛋白的表达用蛋白裂解液裂解后离心取上清，测定浓度后，以各泳道10 μg进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，将转膜后的PVDF膜用含3%的脱脂奶粉的TBST封闭1 h后，分别用anti-BTG2(1∶1 000)和anti-Actin(1∶5 000)的一抗和对应的二抗进行免疫标记，ECL化学发光试剂A、B液1∶1混匀，覆盖于PVDF膜的蛋白面，全自动凝胶成像系统进行曝光。

2　结　果

2.1重组慢病毒载体pCDH-BTG2的构建通过PCR技术获得477 bp的全长BTG2片段(图1A)，将PCR所得片段回收、酶切后插入慢病毒载体pCDH构建pCDH-BTG2，转化E.coliXL 10-gold后，挑取单克隆，提取质粒，用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行双酶切，电泳可见500 bp左右片段(图1B)，DNA测序亦完全正确，表明pCDH-BTG2构建成功。

2.2pCDH-BTG2转染PC3细胞后BTG2的表达将pCDH-BTG2与pRL-CMV经Lipofectamine2000共转染PC3细胞后，收集PC3细胞裂解液，Western-blot检测BTG2的表达。如图2所示，对照空载体pCDH转染的PC3细胞未检测到BTG2的表达，pCDH-BTG2转染的PC3细胞均检测到BTG2的表达。因此，选择BTG2表达较高的4号泳道对应的pCDH-BTG2包装成慢病毒，进行后续试验。

2.3重组慢病毒Lenti-BTG2感染A549细胞后BTG2的表达及其对A549细胞生长的影响重组慢病毒载体pCDH-BTG2包装成慢病毒Lenti-BTG2使用不同浓度的慢病毒感染A549细胞，Western-blot分析BTG2的表达。Lenti-pCDH空病毒组使用anti-BTG2未检测到条带，说明空载体感染的A549细胞BTG2表达量较低或没有表达，而Lenti-BTG2组均检测到BTG2特异性条带，且呈剂量依赖性关系(图3)。重组慢病毒Lenti-BTG2感染A549细胞后第3天和第6天均显著抑制了A549细胞的生长，且BTG2的表达量越高，抑制效应越明显(图4)。结果说明慢病毒Lenti-BTG2包装成功，感染A549细胞后可表达BTG2蛋白，抑制A549细胞的生长。

3　讨　论

人BTG2基因定位于1q32，有2个外显子，编码的蛋白质由158个氨基酸残基组成，属于抗增殖基因家族(即TOB/BTG家族)，是该家族中最早被发现的一员[4]。BTG2基因在正常组织中广泛表达，可作为瞬时早期反应蛋白，参与细胞的分化、凋亡、抑制肿瘤细胞的生长等生理和病理过程。BTG2基因能够被多种途径激活，在细胞衰老和肿瘤的形成过程中发挥重要功能。BTG2与抑癌基因p53、p73、RB等相似，所以被认为是一种新的抑癌基因[9-12]。BTG2在多种肿瘤组织中表达较低或不表达，如胃癌、黑色素瘤、乳腺癌等[13-15]。本室前期工作中发现在肺癌A549细胞中沉默原癌基因p44的表达后， BTG2的表达显著上调。p44是一种雄激素受体共刺激因子，在增殖活跃的前列腺癌细胞内主要定位于细胞质，为细胞增殖所必须。p44亦为肺上皮细胞及肺癌细胞增殖所必须。p44 shRNA沉默p44的表达后，显著抑制肺癌细胞及裸鼠移植瘤的生长[2]。因此推测BTG2参与p44途径，作为负性调节因子参与调节肺癌细胞的发生发展。本研究构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2，并包装成慢病毒，感染A549细胞后，发现BTG2的高表达抑制A549细胞的生长，说明BTG2作为抑癌基因在肺癌的发生发展过程中发挥功能，但其具体机制有待进一步研究。

慢病毒载体是在人类免疫缺陷病毒-1的基础上改造而成的病毒载体系统，能够将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系，其介导的基因表达持续且稳定，免疫原性极小，现已作为转移目的基因的理想载体被广泛应用。重组慢病毒载体pCDH-BTG2的成功构建为进一步研究BTG2在肺癌的发生发展及在p44通路中的作用奠定基础。

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(编辑:张慧茹)

Construction of Recombinant Lentiviral Vector pCDH-BTG2 and Its Expression and Function in A549 Cells

SHENG Xiumei, WANG Zhengxin

Department of Biochemistry, School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vector pCDH-BTG2 and detect its expression and function in A549 cells.MethodscDNA clone plasmid (HsCD00330081) was used as template to amplify the fragment BTG2 by PCR.The fragment was cloned into pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro to generate recombinant lentiviral vector pCDH-BTG2.PC3 cells were transfected with pCDH-BTG2 and its expression was detected by Western-blot.Recombinant lentivirus was produced by 293T cells following co-transfection of pCDH-BTG2 with the packaging plasmids.The resulting recombinant lentivirus Lenti-BTG2 was then used to infect A549 cells.BTG2 expression was detected by Western-blot analysis, and cell growth assays were performed to check the effect of BTG2 on A549 cells.ResultsThe recombinant lentiviral vector pCDH-BTG2 was successfully constructed and could be detected by Western-blot after transfecting PC3 cell.Lentivirus Lenti-BTG2 was successfully constructed and could infect A549 cells.Expression of BTG2 obviously inhibited cell growth of A549 cells.ConclusionThe lentiviral vector pCDH-BTG2 was successfully constructed, which lays the foundation for the research of BTG2 function.We also found that BTG2 inhibits lung cancer cell growth, which provides a potential therapeutic agent for lung cancer.

lentivirus； genes； gene expression； lung neoplasms； tumor cells, cultured； recombination, genetic

2015-12-03

国家自然科学基金(31000046)；国家博士后基金面上项目(2015M571702)；江苏大学高级人才启动基金(11JDG063)

江苏大学医学院 生物化学教研室，镇江212013

生秀梅(1978-)，女，副教授，医学博士. Email:shengxiumei@hotmail.com

R331;R373.9； R394.2； R734.2

A

1672-4194(2016)02-0074-04